赫 衛(wèi) 張 慧

（1 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，黑龍江哈爾濱 150069）

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsiciL.）是辣椒生產(chǎn)中極具破壞力的病原體，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)50%以上，甚至絕收。辣椒疫病發(fā)病范圍廣，生理小種繁多，病原菌極易發(fā)生變異，從而導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生（Pennisi &Agosteo，1998；羅赫榮 等，1999；謝丙炎和吳新平，2000；Oelke et al.，2003），而抗病育種是防治此病害的主要手段之一。但由于缺乏廣泛適用的抗疫病辣椒資源，且辣椒抗疫病遺傳規(guī)律復(fù)雜，抗病機(jī)制不清晰，導(dǎo)致當(dāng)前育種成果進(jìn)展緩慢。因此，辣椒疫病抗性機(jī)制已成為目前研究的重點(diǎn)。本文著重闡述了宿主和病原體的分子機(jī)制研究進(jìn)展，為研究辣椒-疫霉菌病理提供理論指導(dǎo)。

1 辣椒疫病抗性基因

1.1 辣椒疫病抗性基因的定位

辣椒疫霉菌抗性來源的遺傳方式有：單基因遺傳、寡基因遺傳和多基因遺傳。有研究表明，單顯性基因或具有修飾基因的單顯性基因可調(diào)控辣椒對疫霉菌的抗性（Saini &Sharma，1978；Barksdale et al.，1984；Kim &Hur，1990）。在寡基因遺傳方面，前人研究表明，在辣椒材料CM334 中至少兩個(gè)基因共有抗性（Reifschneider et al.，1986，1992；Ortega et al.，1991，1992；Walker &Bosland，1999；Thabuis et al.，2003；Sy et al.，2005）。有研究認(rèn)為，疫病的抗性是指具有基于多峰分布和更高階上位效應(yīng)的多基因遺傳性（Bartual et al.，1991，1993；Pflieger et al.，2001；Lefebvre et al.，2002；Ogundiwin et al.，2005；Toru et al.，2006；Bonnet et al.，2007）。目前，已鑒定出一些與辣椒疫霉菌抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座（QTL）（Thabuis et al.，2004a；Ogundiwin et al.，2005；安靜等，2007；Minamiyama et al.，2007；Kim et al.，2008；Truong et al.，2012；Naegele &Hausbeck，2014）。

辣椒第5 號染色體是疫病抗性的主要定位區(qū)間。Quirin 等（2005）在辣椒第5 號染色體上定位了1 個(gè)與Phyto.5.2緊密相連的基因座。Kim 等（2008）找到了2 個(gè)QTLs，位于辣椒第5 號染色體上的RFLP 標(biāo)記CDI25 和第9 號染色體上的CT211A 標(biāo)記附近。Lu 等（2012）檢測到LG5 的a035_1 和a170_1 之間的一段連續(xù)區(qū)間是主要效應(yīng)位點(diǎn)，并且考慮到上位性效應(yīng)，這些QTL 可以解釋高達(dá)98.25%的抗性表型變異。Mallard 等（2013）確定了1 個(gè)主要的QTL，Pc5.1，位于辣椒第5 號染色體上，與來自不同地理區(qū)域的12 種疫霉菌的分離株抗性相關(guān)。Liu 等（2014）使用基因芯片對辣椒第5 號染色體上的主效QTL 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Phyto5SAR 標(biāo)記位于主效QTL 區(qū)間，Phyto5SAR標(biāo)記的支架序列（scaffold194）包含2 個(gè)疫病抗性候選基因，推測為NBS-LRR基因和SAR8.2A基因。Wang 等（2016）將辣椒疫病抗性基因定位到第5 號染色體的區(qū)間上，僅3.3 cM，鑒定出2 個(gè)候選基因Capana05g000764和Capana05g000769。Siddique 等（2019）應(yīng)用GWAS 在整個(gè)辣椒基因組中檢測到117 個(gè)與辣椒疫病抗性相關(guān)的重要SNP，并將對辣椒疫霉菌的分離株具有廣譜抗性的3 個(gè)主要影響基因座（5.1、5.2 和5.3）定位到辣椒第5 號染色體上。Kim 等（2019）分析了辣椒第5 號染色體上的主要QTL 區(qū)（6.2～139.2 Mb），鑒定出候選抗性基因類似物（RGA），包括14 個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)富含亮氨酸的重復(fù)序列，3 個(gè)受體樣激酶和1 個(gè)受體樣蛋白。這些研究為辣椒疫病抗性的基因篩選和標(biāo)記開發(fā)提供了良好的基礎(chǔ)。

目前，已有大量研究報(bào)道了辣椒中的QTL可轉(zhuǎn)化為分子標(biāo)記，從而進(jìn)行更快速的育種選擇（Quirin et al.，2005；Kim et al.，2008；Truong et al.，2012；Chomkaeo et al.，2014；Wang et al.，2016；Xu et al.，2016）。辣椒第5 號染色體因被多次確定為QTL 位點(diǎn)而備受重視，并開發(fā)了分子標(biāo)記。例如，標(biāo)記Phyto5NBS1可解釋高達(dá)90%的遺傳變異（Liu et al.，2014），標(biāo)記CaNB-5480 最高分離率為86.9%（Kim et al.，2019）。然而，迄今為止，這些公開獲得的分子標(biāo)記通常不能被廣泛應(yīng)用，且已經(jīng)觀察到一些分子標(biāo)記在應(yīng)用于多種種質(zhì)中會出現(xiàn)一定程度的表型和基因型不匹配，這種不匹配限制了標(biāo)記輔助選擇育種的發(fā)展。此外，多標(biāo)記結(jié)合使用可以提高標(biāo)記的利用效率。例如CaNB-5480、CaRP-5130 和CaNB-5330 3 個(gè)標(biāo)記結(jié)合，可提高61 個(gè)辣椒品種的基因分型準(zhǔn)確性（Kim et al.，2019）。

1.2 辣椒疫病抗性相關(guān)基因的鑒定

目前已通過多種方法獲得辣椒疫病抗性基因，但檢測到的基因仍然是有限的。有研究者通過標(biāo)記定位鑒定了可能的抗性基因（Silvar et al.，2008；Zhang et al.，2013；Rehrig et al.，2014；Xu et al.，2016），一些抗性基因在QTL 位點(diǎn)Pc5.1內(nèi)，且非常接近Pc5.1，包括CaPhyto（Wang et al.，2016）、CaDMR1（Rehrig et al.，2014）以及其他可能的基因（Liu et al.，2014）；通過DDRT-PCR 和cDNAAFLP 等技術(shù)篩選出疫霉菌誘導(dǎo)處理后差異表達(dá)的基因，包括β-1，3-葡萄糖聚糖酶基因（Catalina et al.，1999）、磷脂酰肌醇/磷脂酰甘油轉(zhuǎn)化蛋白基因（王永成 等，2008）、辣椒葉綠素a/b 結(jié)合蛋白基因（林明 等，2007）等。Zhang 等（2013）利用同源克隆方法獲得辣椒CaRGA2基因，辣椒接種疫霉菌24 h 時(shí)，該基因在抗病品種CM334 中的表達(dá)量是感病品種的5 倍，被病毒誘導(dǎo)沉默后，抗病品種對疫病的抗性也受到了抑制。

有些基因家族已參與到辣椒對疫霉菌的防御反應(yīng)中。例如，SBP-box（Squamosa-promoter 結(jié)合蛋白）是一種植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)篩選出與疫霉菌防御反應(yīng)相關(guān)的基因CaSBP08、CaSBP11、CaSBP12和CaSBP13。其中，CaSBP08的功能在對疫霉菌的感染防御反應(yīng)中得到了確認(rèn)（Zhang et al.，2020）；CaSBP12過表達(dá)的煙草植株更容易受到疫霉菌感染，而CaSBP12沉默增強(qiáng)了對疫霉菌感染的防御反應(yīng)（Zhang et al.，2018），防御相關(guān)基因（NbPR1a、NbPR1b、CaPO1、CaSAR8.2、CaBPR1和CaDEF1）的 表達(dá)受到不同程度的抑制或誘導(dǎo)，這些結(jié)果表明CaSBP12基因負(fù)調(diào)節(jié)了對疫霉菌感染的防御反應(yīng)。CBL-CIPK 網(wǎng)絡(luò)參與了脅迫反應(yīng)，在辣椒基因組中鑒定出9 個(gè)CaCBL（鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B 樣蛋白）和26 個(gè)CaCIPK（蛋白激酶）基因，當(dāng)植物受到疫霉菌脅迫時(shí)，大多數(shù)CaCBL 和CaCIPK 基因的表達(dá)發(fā)生了改變（Ma et al.，2019）。此外，幾丁質(zhì)酶家族的許多成員參與了植物免疫，其中CaChiIV1和ChiIV3的表達(dá)受辣椒疫霉菌感染的調(diào)節(jié)，CaChiIV1沉默的辣椒植株顯示出對疫霉菌感染敏感性的增加，因此顯示其在特定條件下的共調(diào)節(jié)作用（Ali et al.，2019）。ChiIV3是植物細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)劑，可觸發(fā)針對辣椒疫霉菌的防御信號和致病相關(guān)基因的上調(diào)（Liu et al.，2017）。

辣椒中似乎有幾種不同類型的R基因，其中大多數(shù)R基因是核苷酸結(jié)合和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白（NLR）。辣椒中NLR 基因的大規(guī)模擴(kuò)增，很大程度上是由于長末端重復(fù)逆轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄重復(fù)的結(jié)果（Kim et al.，2017）。乙烯響應(yīng)因子在植物對生物脅迫的響應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，如CaPTI1通過病毒誘導(dǎo)基因沉默降低了防御相關(guān)基因CaPR1、CaDEF1和CaSAR82的表達(dá)以及根系活性來顯著削弱防御反應(yīng)（Jin et al.，2015），CaAP2/ERF064可以通過調(diào)節(jié)植物中PR 基因的轉(zhuǎn)錄來積極調(diào)節(jié)辣椒的抗性反應(yīng)（Jin et al.，2019）。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）是具有對真菌產(chǎn)生的許多多聚半乳糖醛酸酶的識別能力的細(xì)胞外植物蛋白（de Lorenzo et al.，2001），研究表明金黃色葡萄球菌多半乳糖醛酸酶抑制蛋白1 基因（CaPGIP1）可降低轉(zhuǎn)基因煙草植物的敏感性（Wang et al.，2013）。Jones 等（2015）對XEGIP 基因進(jìn)行建模以抑制辣椒疫霉菌產(chǎn)生的木葡聚糖特異性內(nèi)切β-1，4 葡聚糖酶，并攻擊植物細(xì)胞壁中的木葡聚糖鍵（Yoshizawa et al.，2012）。一些非典型的廣譜基因參與到對辣椒疫霉菌感染的防御反應(yīng)中，包括CaPIP1-1（Yin et al.，2015）、VpRPW8s（Lai et al.，2018）等。這些基因在辣椒抵抗疫霉菌感染的防御機(jī)制中起著重要作用，為辣椒疫病抗性的分子解剖奠定了基礎(chǔ)。

1.3 辣椒疫病抗性基因網(wǎng)絡(luò)

盡管賦予辣椒疫病抗性的基因大部分定位在辣椒第5 號染色體上（Mallard et al.，2013；Kim et al.，2017），但尚未鑒定出在廣泛地理區(qū)域或不同遺傳背景下均具有抗性的基因座。辣椒對疫霉菌的抗性是高度復(fù)雜的性狀，可能有大量變異導(dǎo)致抗性（Kim et al.，2017）。常見的SNP 分布在整個(gè)基因組中，其影響低于可檢測的顯著性水平，但占復(fù)雜性狀遺傳力的很大一部分（Yang et al.，2010）。而且，復(fù)雜的性狀在很大程度上受非編碼變體（如啟動子或增強(qiáng)子）的影響（Boyle et al.，2017），許多重要的基因座通常作用較小。因此，Boyle 等（2017）提出了一種全能模型，該模型假設(shè)大多數(shù)遺傳力可以通過對核心疾病相關(guān)途徑之外的基因的影響來解釋。他們認(rèn)為，至少在一個(gè)組織中具有致病性的任何具有調(diào)節(jié)變異的基因，基本上都可能對抗病性產(chǎn)生重要影響。因此，疫病抗性基因很可能是一個(gè)互相影響的基因網(wǎng)絡(luò)。

通過全基因組關(guān)聯(lián)研究，對復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)的理解已大大擴(kuò)展。Richins 等（2010）確定了在接種辣椒疫霉菌條件下的168 個(gè)相關(guān)差異表達(dá)的基因。以2014 年測序完成的辣椒全基因組作為參考基因組，為辣椒疫霉菌抗性基因表達(dá)研究提供了重要借鑒。Wang 等（2015）采用了RNA-seq 技術(shù)對辣椒疫病侵染前后的根部差異基因進(jìn)行分析，遺憾的是只對侵染后的單一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了分析。Li 等（2020）同樣采用RNA-Seq 方法闡明了在感染辣椒疫霉菌后多時(shí)間點(diǎn)的根部差異基因，推斷苯丙烷類生物合成途徑，尤其是其分支衍生的肉桂醛和木質(zhì)素，在辣椒根部對疫霉菌的抗性中起重要作用。但是，這些基因識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）的能力尚不清楚。

2 疫霉菌致病機(jī)制

2.1 疫霉菌的致病基因

疫霉菌病原體代表了一種獨(dú)特的進(jìn)化譜系，其中致病性已獨(dú)立獲得，因此，迫切需要了解并破壞驅(qū)動感染的進(jìn)程。目前很少受到關(guān)注的一個(gè)領(lǐng)域是感染期間疫霉菌基因表達(dá)的調(diào)節(jié)?；虮磉_(dá)不僅調(diào)節(jié)疫霉菌的外觀形態(tài)，更影響著疫霉菌的毒力。Safdar 等（2017）構(gòu)建了含有辣椒疫霉菌LRR 功能域的一種酶PcLRR-RK1 的沉默轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子改變了疫霉菌的孢子囊形狀、大小，降低了孢子囊與游動孢子的產(chǎn)量，同時(shí)影響了孢子囊萌發(fā)及穿透寄主組織細(xì)胞的能力，從而導(dǎo)致辣椒疫霉菌毒力降低。疫霉菌中編碼壞死和乙烯誘導(dǎo)肽1 類似蛋白（NLPs）的基因家族，又稱NPP，是一組疫霉菌分泌的毒素，代表了一類壞死激發(fā)子，能夠引發(fā)許多雙子葉植物防御反應(yīng)和細(xì)胞死亡（Fellbrich et al.，2002；Qutob et al.，2002；Bailey et al.，2005）。Ottmann 等（2009）觀察到NLP 的晶體結(jié)構(gòu)與海洋生物產(chǎn)生的細(xì)胞溶解毒素表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)相似性，表明該蛋白通過質(zhì)膜破壞和細(xì)胞溶解作用促進(jìn)了宿主感染。Feng 等（2011）發(fā)現(xiàn)從中國分離出的高毒力辣椒疫霉菌SD33 中存在NLP，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NLP 在辣椒的病癥發(fā)展中起重要作用（Feng &Li，2013；Feng et al.，2014）。有研究表明，8 個(gè)選定的NLP 基因在辣椒疫霉菌的發(fā)育和植物感染階段差異表達(dá)，對10 個(gè)克隆的NLP 的功能分析表明，Pc11951、Pc107869、Pc109174和Pc118548能夠誘導(dǎo)辣椒中的細(xì)胞死亡（Chen et al.，2018）。Fu等（2015）確定了疫霉菌中的果膠酸裂解酶基因家族的幾個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的成員，這些成員在感染過程中被高度誘導(dǎo)，與疫霉菌的毒力相關(guān)，并且可能是效應(yīng)子。病原體甚至與宿主植物構(gòu)成蛋白復(fù)合體以致病，辣椒疫霉菌的抑素PcINF1 與辣椒SRC2-1構(gòu)成膜靶向PcINF1-SRC2-1 復(fù)合物，觸發(fā)了辣椒植株的細(xì)胞死亡，是PcINF1 誘導(dǎo)的辣椒免疫所必需的（Liu et al.，2015）。上述研究概述了辣椒疫霉菌的致病基因，為進(jìn)一步闡明這種破壞性病原體的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

2.2 疫霉菌的效應(yīng)子

疫霉菌可以分泌大量不同毒性或無毒因子到植物中，從而操控植物的生理生化過程，這些因子即效應(yīng)子。效應(yīng)子編碼被抗病宿主識別的病原體相關(guān)分子模式/微生物相關(guān)分子模式（PAMPs/MAMPs），并觸發(fā)模式觸發(fā)免疫（PTI）。辣椒疫霉菌已經(jīng)進(jìn)化出多種多樣的分泌效應(yīng)子，可以抑制PTI 并引發(fā)效應(yīng)觸發(fā)易感性（ETS）（Jones &Dangl，2006；Hein et al.，2009；Gill et al.，2015）。這些效應(yīng)子操縱宿主的過程可以創(chuàng)造有利于病原菌定殖的環(huán)境。在感病植物中，效應(yīng)子通過多種機(jī)制抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)從而增加感病植物的感病性；抗病植物中的抗病基因產(chǎn)物識別效應(yīng)子，引發(fā)抗病植物的過敏性細(xì)胞壞死和有效的防衛(wèi)反應(yīng)（Kamoun，2003）。

Stam 等（2013）利用辣椒疫霉菌參考基因組，確定了病原體效應(yīng)子。辣椒疫霉菌產(chǎn)生的幾種效應(yīng)子，例如RXLR、CRN 類的效應(yīng)子，被認(rèn)為在辣椒的感病過程中起重要作用。在辣椒疫霉菌基因組中已經(jīng)鑒定出超過400種候選RXLP效應(yīng)子（Lamour et al.，2012；Stamet al.，2013）。如辣椒疫霉菌RXLR 效應(yīng)子PcAvr3a12，通過靶向和抑制新型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶FKBP15-2 來促進(jìn)感染（Fan et al.，2018）。CRN 效應(yīng)子是卵菌中除RxLR 效應(yīng)子外的一種重要的胞質(zhì)效應(yīng)子，通過保守基序LxLFLAK 檢索辣椒疫霉菌全基因組，鑒定CRN 效應(yīng)子84 個(gè)（Stam et al.，2013）。保守的CRN 效應(yīng)子家族具有引發(fā)寄主植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，誘導(dǎo)植物葉片皺縮和壞死的能力（Schornack et al.，2010）。這種誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡的能力可以和毒力功能分開（Amaro et al.，2018）。瞬時(shí)表達(dá)PcCRN4增強(qiáng)了煙草上的致病疫霉菌毒力；沉默基因PcCRN4顯著降低該基因毒力，煙草的病程相關(guān)基因PR1b被顯著誘導(dǎo)，有大量的胼胝質(zhì)沉積，表明CRN 具有引發(fā)植物防御反應(yīng)的能力（Mafurah et al.，2015）。PcNMRAL1 是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)辣椒疫霉菌中大量效應(yīng)子的表達(dá)，可介導(dǎo)生物體向壞死體的轉(zhuǎn)化，可能會驅(qū)動植物疫病周期（Pham et al.，2018）。疫霉菌基因組包含5 個(gè)推定的脯氨酰4-羥基酶（P4Hs），在菌絲體中，所有P4Hs 均響應(yīng)缺氧而下調(diào)，但PcP4H1的表達(dá)受影響最大，感染植株時(shí)Pc4H1被上調(diào)了110 倍以上，Pc4H5被上調(diào)了7 倍，而其他P4H 的表達(dá)則保持不變（Song et al.，2019）。

Reeves 等（2013）從新墨西哥辣椒品種NMCA10399 中鑒定了辣椒疫霉菌含有抗性基因抑制劑（Ipcr）基因，表明1 個(gè)單顯性基因抑制了多基因宿主對疫霉菌多個(gè)分離株的抗性，并且這個(gè)單顯性基因?qū)λ胁“Y的抗性都有抑制。辣椒種群中Ipcr基因的作用方式尚不清楚。Ipcr基因的宿主始終是完全易感的，因而增加了鑒定效應(yīng)子靶標(biāo)的難度。

3 展望

前人相關(guān)研究表明，很難將辣椒疫病抗性引入適應(yīng)性強(qiáng)的易感品種中，回交時(shí)抗性低于供體親本，這很可能是由于微效抗性基因的缺失（Palloix et al.，1990）。輪回選擇已被用于將多基因抗性轉(zhuǎn)移到優(yōu)良材料中（Thabuis et al.，2004b）。然而，抗性基因與低產(chǎn)量、小果實(shí)及較弱的植株等相關(guān)基因連鎖，是廣泛采用抗性品種的主要限制。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，應(yīng)用于疫病抗性相關(guān)基因的研究，已成為解決常規(guī)育種問題的有效手段。發(fā)掘新基因無論是對于深入了解抗病的分子機(jī)制還是為基因研究做準(zhǔn)備，都具有較大的研究價(jià)值。目前對辣椒疫病抗性相關(guān)基因表達(dá)、分子標(biāo)記、遺傳圖譜、QTL定位、同源克隆等研究均取得了重要進(jìn)展（Kim et al.，2008；Liu et al.，2014）。但對涉及疫病相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)缺乏研究，且其抗性分子機(jī)理也不清楚。隨著生物學(xué)技術(shù)手段的不斷發(fā)展，辣椒疫病抗性分子機(jī)理的研究將更加深入。