鈍頂螺旋藻耐Cd性能及其生理響應(yīng)

彭 方，胡 超

(湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000)

鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)屬藍(lán)藻門(mén)，絲狀藻，藻絲寬4 ～5 μm，長(zhǎng)400 ～ 600 μm，易附著在基質(zhì)上形成生物膜體系，有利于污水的分離。有研究報(bào)道[5-6]，鈍頂螺旋藻對(duì)污水中的氮磷具有較強(qiáng)的去除能力，并對(duì)水體中Cd2+表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附和富集能力。這表明其可能在利用污水中氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)的同時(shí)有效地去除污水中的重金屬，對(duì)處理復(fù)合污水具有較好的潛力[7-9]。雖然國(guó)內(nèi)外大量研究從抗氧化層面研究了微藻對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)，但缺乏響應(yīng)機(jī)理的生理學(xué)層面分析，這使鈍頂螺旋藻在水處理和水污染修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。系統(tǒng)研究鈍頂螺旋藻的耐Cd特性及其生理響應(yīng)可為響應(yīng)機(jī)理的研究提供重要參考。

本文研究鈍頂螺旋藻在不同濃度鎘離子脅迫下，細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性的變化，探討其對(duì)重金屬鎘的耐受性，旨在為進(jìn)一步處理含重金屬的廢水提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所國(guó)家淡水藻種庫(kù)(FACHB)，用CdCl2(分析純)配置1.0 g/L的Cd2+儲(chǔ)備液。

采用Zarrok培養(yǎng)基[10]。藻細(xì)胞經(jīng)超純水清洗3次，在無(wú)菌的條件下用接種環(huán)將藻細(xì)胞接種于含培養(yǎng)基的三角瓶中，混勻，在溫度25±1 ℃，光照強(qiáng)度2500 Lux，光暗比為12:12的條件下培養(yǎng)，每天定時(shí)搖瓶3次。培養(yǎng)基使用前需經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌(121 ℃，0.5 h)處理，冷卻至室溫后用1.0 mol/L、0.1 mol/L和0.01 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH為9.0±0.1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鈍頂螺旋藻毒性實(shí)驗(yàn)

取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鈍頂螺旋藻藻液過(guò)濾，并用超純水清洗3次，收集藻細(xì)胞，將藻細(xì)胞接種到不同濃度重金屬培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)定Cd2+的濃度分別為0、5、10、20、40、80 mg/L，初始藻生物量取OD560=0.1(干重濃度0.1 g/L)，控制培養(yǎng)條件一致，實(shí)驗(yàn)周期為4 d，每天定時(shí)取樣測(cè)定生物量濃度。每個(gè)梯度設(shè)定3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.2.2 蛋白質(zhì)及酶活性的測(cè)定

取培養(yǎng)96 h后的藻液15 mL置于25 mL離心管中離心(4000 r/min，10 min)，棄去上清液，然后加入15 mL超純水后離心洗滌，重復(fù)3次后棄去上清液，改加15 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)，于冰浴中超聲破碎10 min(采用SZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉粹機(jī)，其間工作3 s，間歇2 s)，離心(4 ℃，10000 r/min，15 min)收集上清液，保存于冰箱中待測(cè)。可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定采用試劑盒直接測(cè)定(試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所)。所有酶比活以每毫克蛋白計(jì)。

1.2.3 藻細(xì)胞的形態(tài)觀察

取培養(yǎng)96 h后的藻液15 mL置于25 mL離心管中離心(4000 r/min，10 min)，棄去上清液，然后加入15 mL超純水后離心洗滌，重復(fù)3次后棄去上清液，收集藻細(xì)胞備用。利用掃描電鏡(SEM)觀察藻細(xì)胞形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率用式(1)計(jì)算：

X%=(I0-I)/I0×100%

(1)

式中:X為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，I0為對(duì)照組，I為實(shí)驗(yàn)組。利用Logistic曲線(xiàn)擬合抑制率，計(jì)算出Cd2+的96 h-EC 50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同Cd2+濃度對(duì)鈍頂螺旋藻生長(zhǎng)的影響

不同濃度重金屬鎘連續(xù)暴露4 d后，鈍頂螺旋藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和干重如圖1所示。從圖1可以看出，較低濃度(5 ～ 20 mg/L)的Cd2+對(duì)鈍頂螺旋藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定程度的促進(jìn)作用，最大促進(jìn)作用分別為11.9%、12.9%和5.1%；隨著溶液中Cd2+濃度的增大，鈍頂螺旋藻的生長(zhǎng)又會(huì)受到抑制，并且重金屬濃度越大，藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到的抑制作用越強(qiáng)，Cd2+對(duì)鈍頂螺旋藻的96 h-EC 50為38.3 mg/L。

圖1 不同濃度Cd2+對(duì)鈍頂螺旋藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)(a)及生物量(b)的影響

鈍頂螺旋藻的藻密度和干重值越大，藻絲越完好無(wú)損，說(shuō)明其生長(zhǎng)得越好。在電鏡下觀察鈍頂螺旋藻在不同濃度Cd2+暴露下的形態(tài)變化，結(jié)果如圖2所示。正常對(duì)照組中(圖2A、圖2D)，藻絲形狀呈規(guī)則的螺旋卷曲狀，藻體較長(zhǎng)，完好無(wú)斷裂，藻體頂端細(xì)胞鈍圓，藻細(xì)胞飽滿(mǎn)光滑；在低Cd2+濃度下(5 ～ 20 mg/L)，藻絲形狀發(fā)生畸變，部分呈螺旋，出現(xiàn)斷藻現(xiàn)象，藻細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的干癟(圖2B、圖2E)；而高濃度處理(Cd2+> 20 mg/L)則斷裂現(xiàn)象嚴(yán)重，已無(wú)法觀察到完整的螺旋形藻絲，均為斷裂碎片，藻體表面褶皺加深(圖2C、圖2F)。以上結(jié)果表明，低濃度Cd2+對(duì)鈍頂螺旋藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，對(duì)藻細(xì)胞的形態(tài)存在影響；高濃度Cd2+對(duì)藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制和損傷作用。

A-C：1000倍；D-F：15000倍圖2 Cd2+脅迫下鈍頂螺旋藻電鏡圖片

2.2 不同Cd2+濃度對(duì)鈍頂螺旋藻中可溶性蛋白的影響

可溶性蛋白大多數(shù)是功能蛋白和參與各種代謝的酶類(lèi)，是植物適應(yīng)環(huán)境、增強(qiáng)抗逆性的基礎(chǔ)，因此可作為衡量植物代謝水平的重要指標(biāo)[3,11-12]。不同濃度Cd2+暴露下，藻細(xì)胞中可溶性蛋白的含量如圖3所示，隨著Cd2+濃度的增加，可溶性蛋白呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這與葉鵬浩等[13]及葸玉琴等[14]的研究結(jié)果一致。本研究中，在Cd2+濃度為5 mg/L時(shí)，可溶性蛋白濃度達(dá)到最大；當(dāng)Cd2+濃度超過(guò)10 mg/L時(shí)，可溶性蛋白濃度顯著降低。其主要原因是較低濃度的Cd2+能誘導(dǎo)鈍頂螺旋藻產(chǎn)生可溶性蛋白以減輕自身的傷害，但隨著Cd2+濃度和處理時(shí)間的增加，被藻體吸收的Cd2+與-SH基結(jié)合導(dǎo)致蛋白變性，也可能是Cd2+取代了酶蛋白的活性中心，影響了酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻，從而降低了藻細(xì)胞中可溶性蛋白的含量[3,12]。

2.3 不同Cd2+濃度對(duì)鈍頂螺旋藻中抗氧化酶活性的影響

在重金屬脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，通常情況下，植物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)通過(guò)清除自由以維持體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，一旦超過(guò)植物自我清除的能力，這些自由基會(huì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化、膜損傷和酶失活，從而影響細(xì)胞的性能和生存能力，甚至導(dǎo)致植物死亡[15-17]。

圖3 不同濃度Cd2+對(duì)鈍頂螺旋藻中可溶性蛋白的影響

SOD 是植物體內(nèi)的重要保護(hù)酶，能夠通過(guò)歧化反應(yīng)有效地將活性較強(qiáng)的超氧自由基(O2-)轉(zhuǎn)化為活性較弱的H2O2，而POD、CAT可以清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2，進(jìn)而防止O2-與H2O2生成活性更強(qiáng)的羥基自由基(OH·)[18]。不同Cd2+濃度下，鈍頂螺旋藻中抗氧化酶活性影響如圖4、圖5、圖6所示。相對(duì)于對(duì)照組(無(wú)Cd2+添加)，Cd2+脅迫下，鈍頂螺旋藻中的SOD、POD和CAT活性均有提高，且在Cd2+濃度為20 mg/L時(shí)，3種酶的活性達(dá)到最大；隨著重金屬Cd2+濃度增加，3種酶的活性均表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象。這表明Cd2+脅迫能促使鈍頂螺旋藻抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，清除體內(nèi)過(guò)多的自由基而保持相對(duì)活性，且在低濃度Cd2+條件下，應(yīng)激反應(yīng)更顯著；然而高濃度(>20 mg/L)使藻體的正常代謝受到影響甚至遭到破壞，抑制了抗氧化系統(tǒng)反應(yīng)能力，導(dǎo)致抗氧化酶活性顯著下降。

圖4 不同濃度Cd2+對(duì)鈍頂螺旋藻中SOD活性的影響

圖5 不同濃度Cd2+對(duì)鈍頂螺旋藻中POD活性的影響

圖6 不同濃度Cd2+對(duì)鈍頂螺旋藻中CAT活性的影響

3 結(jié)論

雖然重金屬鎘對(duì)鈍頂螺旋藻有一定的毒害作用，但在低濃度的鎘(低于20 mg/L)脅迫下，鈍頂螺旋藻可調(diào)節(jié)藻細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量及抗氧化酶(SOD、POD及CAT)活性來(lái)抵御外界重金屬的毒害作用以保證其正常生長(zhǎng)；鈍頂螺旋藻對(duì)低濃度鎘具有良好的適應(yīng)性和耐受性，可為鈍頂螺旋藻應(yīng)用于污水處理提供一定的理論參考。