楊傳倫 張心青 馬春峰 王秀芝 李佳明 楊丹丹

摘 ? ?要：為了提高沼澤紅假單胞菌菌劑發(fā)酵水平，并將菌劑應(yīng)用于生產(chǎn)，本研究運用單因素試驗對其培養(yǎng)溫度、pH、接種量、光照發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，并篩選了其培養(yǎng)基需要的最佳碳源、氮源、微量元素及無機鹽，然后運用Plackett-Burman試驗獲得了影響發(fā)酵菌量的顯著因素，最后通過最陡爬坡試驗確定了最佳培養(yǎng)基配方，并將優(yōu)化配方進行20 L放大培養(yǎng)，同時開展了水產(chǎn)養(yǎng)殖水體改良試驗。結(jié)果表明，其優(yōu)化培養(yǎng)條件為溫度33 ℃，pH7.0，初期培養(yǎng)接種量20%～40%，光照強度4 000 lx;優(yōu)化培養(yǎng)基配方為檸檬酸1.0 g·L-1，牛肉膏1.8 g·L-1，酵母膏1.0 g·L-1，蛋白胨1.0 g·L-1，乙酸鈉1.0 g·L-1，硫酸鎂0.4 g·L-1，硫酸亞鐵8.0 mg·L-1，氯化鈣0.15 g·L-1，磷酸二氫鉀0.2 g·L-1，VB6 0.21 mg·L-1，復(fù)合無機鹽0.5 mL·L-1，pH 7.0。此條件下可獲得沼澤紅假單胞菌菌量8.65×109 CFU·mL-1，作為生態(tài)養(yǎng)殖的優(yōu)良改良劑，明顯提高了水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：沼澤紅假單胞菌;培養(yǎng)基優(yōu)化;Plackett-Burman設(shè)計;水產(chǎn)養(yǎng)殖

中圖分類號：Q815 ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.11.003

Optimization， Amplification and Application of Fermentation Medium for Rhodopseudomonas palustris

YANG Chuanlun1， ZHANG Xinqing1，MA Chunfeng1，WANG Xiuzhi1， LI Jiaming2，YANG Dandan

（1.Chambroad Chemical Industry Research Institute Co.，Ltd.， Binzhou， Shandong 256500， China;2.Shandong Chambroad Environmental Protectiom Material Co.，Ltd.， Binzhou， Shandong 256500， China）

Abstract： To improve the fermentation level of Rhodopseudomonas palustris and apply the agent to production， the experiment was conducted from the following aspects. Firstly， single factor experiment was used to optimize the fermentation conditions of temperature， pH， inoculum amount and light， and screen the optimal carbon， nitrogen， trace elements and inorganic salts by single factor experiment. Secondly， the Plackett Burman test was used to obtain the significant factors affecting the amount of fermentation bacteria. Finally， the best medium formula was determined through the steepest climbing test. The optimized formula was cultured in 20 L scale-up;meanwhile， the aquaculture water body improvement test was carried out. The results showed that the optimum culture conditions was temperature 33 ℃， pH 7.0， initial curture inoculation amount 20%-40%， light intensity 4 000 lx. The optimized medium formula was citric acid 1.0 g·L-1， beef extract 1.8 g·L-1， yeast extract 1.0 g·L-1， peptone1.0 g·L-1， sodium acetate1.0 g·L-1， magnesium sulfate 0.4 g·L-1， ferrous sulfate 8.0 mg·L-1， calcium chloride 0.15 g·L-1， potassium dihydrogen phosphate 0.2 g·L-1， VB6 0.21 mg·L-1， compound inorganic salt 0.5 mL·L-1， pH 7.0.Under the above condition， the bacterial count of Rhodopseudomonas palustris could reach 8.65×109 CFU·mL-1， which significantly increased the yield of aquaculture as an excellent improver of ecological aquaculture.

Key words： Rhodopseudomonas palustris; medium optimization; Plackett Burman design; aquaculture

沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）屬于紅螺菌科紅假單胞菌屬，是一種不產(chǎn)氧光合細菌，是自然界廣泛存在的一類具有光能合成體系的原核生物[1-3]。在厭氧光照、好氧光照和好氧黑暗環(huán)境中都能很好生長，它不僅能進行光合作用，固定、同化和降解有機物及某些有毒物質(zhì)，如降低COD、 BOD、氨氮量，降低硫化氫，還可以增加溶氧，改善水質(zhì)，是養(yǎng)殖水體生物修復(fù)領(lǐng)域研常用的菌種[4-8]。沼澤紅假單胞菌富含各種生物活性蛋白、泛酸、葉酸和多種維生素，可作為飼料添加劑用于經(jīng)濟動物的養(yǎng)殖，是農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》規(guī)定可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種[9-10]。

目前，沼澤紅假單胞菌的應(yīng)用主要集中在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，如劉小燕等[11]研究了沼澤紅假單胞菌 R-3 對草魚養(yǎng)殖及水質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)沼澤紅假單胞菌可改善養(yǎng)殖水質(zhì)，提高草魚免疫能力和成活率，促進草魚生長;文剛等[12]研究了沼澤紅假單胞菌 R-3 去除水體中氨氮的特性，表明沼澤紅假單胞菌具有高效去除殖水體中氨氮的能力;許志強等[13]研究了沼澤紅假單胞菌在暗紋東方鲀育苗上的應(yīng)用，表明水體中投放沼澤紅假單胞菌，能顯著的提高暗紋東方鲀仔魚育成率以及生長。此外，沼澤紅假單胞菌還有在動物飼料中的應(yīng)用，如提高生長性能和改善血液生理生化指標[14-15]，油田廢水處理，降低焦油中酚類，去除重金屬離子等環(huán)保上面的應(yīng)用[16-18];以及其他方面的應(yīng)用，如對植物、菌類、藻類等生長的促進作用[19-21]。

本研究所述沼澤紅假單胞菌同樣具有降低水體氨氮、亞硝酸鹽等優(yōu)化物質(zhì)，有效增加水體溶解氧，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)量的作用。本研究重點對該澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，提高菌劑發(fā)酵水平，并應(yīng)用于實際生產(chǎn)，評價其實際應(yīng)用效果，旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)提供一種優(yōu)良菌劑、改善水質(zhì)條件、促進水產(chǎn)行業(yè)增產(chǎn)增收提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 沼澤紅假單胞菌：黃河三角洲京博化工研究院有限公司生物育種研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 初始發(fā)酵培養(yǎng)基：檸檬酸3.5 g·L-1，牛肉膏3.3 g·L-1，硫酸鎂0.5 g·L-1，硫酸亞鐵2 mg·L-1，復(fù)合無機鹽0.5 mL·L-1（EDTA 0.5 g·L-1，硫酸鋅0.01 g·L-1，硼酸0.03 g·L-1，氯化錳0.003 g·L-1，氯化鈣0.02 g·L-1，氯化銅0.001 g·L-1，鉬酸鈉0.003 g·L-1），pH 7.0～7.4。

1.1.3 試驗儀器 HS-800D恒溫水槽：太倉市利達試驗設(shè)備有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠;722型可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司;精密pH計：上海雷磁儀器廠;HC-2518R高速冷凍離心機：科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司;超凈工作臺：蘇州凈化公司;Leica DM IL LED倒置顯微鏡：徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司;智能光照培養(yǎng)箱：上海捷呈實驗儀器有限公司;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 菌體濃度檢測方法 （1）活菌計數(shù)法：顯微鏡直接計數(shù)法。

（2）分光光度法：采用722型可見分光光度計，以滅菌后的液體培養(yǎng)基為空白對照，將新鮮發(fā)酵培養(yǎng)液稀釋至合適倍數(shù)，于660 nm 處測定發(fā)酵液OD660值。

1.2.2 試驗設(shè)計 （1）沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)條件篩選。以初始發(fā)酵配方作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用單因素試驗對溫度（28，30，33，35，37 ℃）、初始pH值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）、接種量（5%，10%，15%，20%，25%）、光照強度（1 000，2 000，3 000，4 000，5 000 lx）等沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)條件進行篩選。具體操作方法：試驗選用500 mL透光塑料瓶進行培養(yǎng)，裝液量90%，初始pH 7.0，接種量20%，白熾燈光照4 000 lx，溫度33 ℃，靜止密封培養(yǎng)，每隔8 h搖晃一次塑料瓶，培養(yǎng)周期5 d，檢測660 nm波長下菌劑稀釋10倍的OD660值。其中，各培養(yǎng)條件的單因素試驗均以相關(guān)的因素設(shè)置替換操作方法中的相應(yīng)條件即可，其他條件不變。

（2）沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培基優(yōu)化。以菌量為衡量標準，以初始發(fā)酵配方作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因素試驗篩選最佳碳源（葡萄糖、蔗糖、碳酸鈉、乙酸鈉、DL-蘋果酸、丁二酸鈉、甘油），氮源（酵母膏、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、尿素），無機鹽及微量元素（0.1 g·L-1硫酸錳、氯化鈣、碳酸鈣，0.2 g·L-1磷酸二氫鉀，0.3 g·L-1磷酸氫二鉀，2 mg·L-1硫酸銅，0.2 mg·L-1VB6，0.1mg·L-1生物素），其中碳源試驗以所選碳源等濃度替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的檸檬酸，氮源試驗以所選氮源等濃度替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的牛肉膏，微量元素試驗則在基礎(chǔ)培養(yǎng)集中按各自設(shè)計的濃度直接添加。

依據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基及單因素試驗，選擇10個因素（檸檬酸、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣、磷酸二氫鉀、VB6）設(shè)計12組的Plackett-Burman試驗，每個因素取高低 2 個水平，詳見表1，12個組合詳見表2。再根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選擇硫酸亞鐵、VB6、牛肉膏3個因素設(shè)計最陡爬坡試驗（表4）。

單因素、Plackett-Burman和最陡爬坡試驗均選用500 mL透光塑料進行培養(yǎng)，裝液量90%，接種量20%，初始pH 7.0，白熾燈光照4 000 lx，溫度33 ℃，靜止密封培養(yǎng)，每隔8 h搖晃一次塑料瓶，培養(yǎng)周期5 d，顯微鏡直接計數(shù)法檢測菌量。

1.2.3 沼澤紅假單胞菌20 L放大驗證 對前述試驗獲得的優(yōu)化配方進行20 L放大驗證，培養(yǎng)步驟如下。

（1）菌種活化：將液體菌種接種在透光性較好的試管（25 mm×180 mm）中活化，裝液量90%，接種量40%，初始pH 7.0，白熾燈光照4 000 lx，溫度33 ℃，靜止密封培養(yǎng)，培養(yǎng)時間4 d，培養(yǎng)期間每隔8 h搖晃一次塑料瓶，使沼澤紅假單胞菌充分接受光照，利于生長，4 d后明顯有菌劑固有的特殊氣味，顏色由淺紅、紅、逐漸變?yōu)榱思t褐色。

（2）一級種子培養(yǎng)：一級種子選用500 mL透光塑料瓶進行培養(yǎng)，裝液量90%，接種量30%，初始pH 7.0，白熾燈光照4 000 lx，溫度33 ℃，靜止密封培養(yǎng)，培養(yǎng)時間3 d，培養(yǎng)期間每隔8 h搖晃一次塑料瓶，3 d后明顯有菌劑固有的特殊氣味，顏色由淺紅、紅、逐漸變?yōu)榱思t褐色。

（3）20 L擴大培養(yǎng)：生產(chǎn)光合細菌選用20 L透光塑料桶，白熾燈光照強度4 000 lx，控制溫度33 ℃，密封，裝液量90%，接種量10%，明顯有菌劑固有的特殊氣味，顏色由淺紅、紅、逐漸變?yōu)榱思t褐色，跟蹤7 d，檢測OD660及菌量生長曲線。

1.2.4 沼澤紅假單胞菌菌劑應(yīng)用 將最優(yōu)配方生產(chǎn)的沼澤紅假單胞菌菌劑應(yīng)用于南美白對蝦，跟蹤蝦塘生長理化指標及南美白對蝦的生長情況。試驗于山東省東營市利津縣某養(yǎng)殖戶蝦塘開展，兩個蝦塘面積均為0.5 hm2，水深均為2 m。采用擴大培養(yǎng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖專用沼澤紅假單胞菌劑對試驗組蝦塘水體進行改良，對照組蝦塘作未用該菌劑處理，其它條件均一致。改良方法：2019年8月10日上午8：00第1次潑灑菌劑;2019年8月25日上午8：00第2次潑灑菌劑，每次菌劑施用量為15.0 L。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)條件篩選

2.1.1 溫度 由圖1可知，在溫度為28～37 ℃范圍內(nèi)，OD660呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，至33 ℃時達到最大值且顯著高于其他處理。綜合而言，最佳溫度選擇33 ℃。

2.1.2 初始pH 由圖2可知，在pH為6.0～8.0的范圍內(nèi)，OD660呈先增加后降低的趨勢，至pH 7.0達到最大值，但其與pH 6.5和pH 7.5時差異不顯著。綜合而言，最佳pH值選擇7.0。

2.1.3 接種量 由圖3可知，隨著接種量的增加，OD600先增加后趨于穩(wěn)定，至接種量20%時達到最大值，但在接種量10%～25%的各處理之間差異均未達顯著水平，說明大于等于10%的接種量基本不會影響最終菌量。在后期20 L及400 L的放大培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，增大接種量，可以避免發(fā)酵過程中的染菌風險，縮短發(fā)酵周期，特別是在初期菌種培養(yǎng)階段，接種量宜在20%～40%，在逐級放大的最后可將接種量降至10%～20%。

2.1.4 光照強度 由圖4可知，光照強度1 000～5 000 lx，OD600呈先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，當大于等于3 000 lx時，其對菌體生長影響不顯著，為了使效果穩(wěn)定，故最佳光照選擇4 000 lx。

2.2 沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培基優(yōu)化

2.2.1 碳源篩選 由圖5可知，培養(yǎng)3 d，沼澤紅假單胞菌發(fā)酵效果表現(xiàn)為檸檬酸效果最佳，其次是甘油、乙酸鈉、DL-蘋果酸;培養(yǎng)5 d，沼澤紅假單胞菌發(fā)酵效果表現(xiàn)最佳仍為檸檬酸，其次是乙酸鈉。綜合而言，檸檬酸作為碳源較好。

2.2.2 氮源篩選 由圖6可知，沼澤紅假單胞菌有機氮源的利用要顯著優(yōu)于無機氮源，較好的有機氮源依次是牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨。

2.2.3 無機鹽及微量元素 添加由圖7可知，與對照（無添加）相比較，添加VB6、氯化鈣、磷酸二氫鉀均能使菌體顯著增加，磷酸氫二鉀、生物素、碳酸鈣作用不顯著，而硫酸銅則表現(xiàn)出顯著抑制菌體生長的現(xiàn)象，可能和不同微量元素的作用機制及添加濃度有關(guān)。

2.2.4 Plackett-Burman試驗 由Plackett-Burman試驗結(jié)果如表2所示，采用Design Expert8.0.6軟件進行分析得到最佳擬合方程為：

菌量=6.50-0.094×A-0.15×B-0.11×C+0.028×D-0.056×E+0.014×F+0.65×G-0.036×H+0.036×J+0.35×K

由分析結(jié)果可知，此模型的P值為0.029 2<0.05，說明此模型顯著，具有統(tǒng)計學意義，其決定系數(shù)為0.999 9，校正系數(shù)為0.998 4，也能說明該模型的合理性。由表3可知，各因子對產(chǎn)光合細菌發(fā)酵水平影響表現(xiàn)為硫酸亞鐵（G）>VB6（J）>牛肉膏（B）>酵母膏（C）>檸檬酸（A）>氯化鈣（H）>乙酸鈉（E）>磷酸二氫鉀（I）>蛋白胨（D）>硫酸鎂（F），對菌量有顯著影響（P<0.05）的因素為硫酸亞鐵、VB6、牛肉膏，其中硫酸亞鐵、VB6是正效應(yīng)，牛肉膏是負效應(yīng)，其他因素的變化對產(chǎn)菌量影響不顯著，根據(jù)選擇硫酸亞鐵、VB6、牛肉膏進行下一步最陡爬坡試驗。

2.2.5 最陡爬坡試驗 由表4可知，隨著硫酸亞鐵及VB6濃度的增加，牛肉膏濃度的降低，菌量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且發(fā)酵液顏色呈現(xiàn)逐級加深的現(xiàn)象，這和硫酸亞鐵的添加量有密切的關(guān)系，綜合衡量菌量及發(fā)酵菌劑顏色，選擇試驗組5為最佳配方，菌量可達到8.65×109 CFU·mL-1，該配方為檸檬酸1.0 g·L-1，牛肉膏1.8 g·L-1，酵母膏1.0 g·L-1，蛋白胨1.0 g·L-1，乙酸鈉1.0 g·L-1，硫酸鎂0.4 g·L-1，硫酸亞鐵8.0 mg·L-1，氯化鈣0.15 g·L-1，磷酸二氫鉀0.2 g·L-1，VB6 0.21 mg·L-1，復(fù)合無機鹽0.5 mL·L-1，pH 7.0。

2.3 沼澤紅假單胞菌20 L放大驗證

由圖8可知，在最優(yōu)配方的20 L放大試驗中，發(fā)酵7 d菌量可達到8.96×109 CFU·mL-1，其與OD660之間的關(guān)系：菌量=151.25×OD660（R2=0.987 0，P=0.032<0.05）。

2.4 沼澤紅假單胞菌菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

由表5可知，養(yǎng)殖池塘使用沼澤紅假單胞菌菌劑后顯著降低了池塘的氨氮和亞硝酸鹽含量，至使用30 d時，二者分別較使用前降低了99.4%，99.0%，同時水中溶解氧由顯著增加了54.3%，有效改善了水體環(huán)境。同時，通過一個月的時間，兩次施用該菌劑，使得南美白對蝦快速生長，平均體重由（25.0±0.10） g·尾-1增加至（52.6±0.11）g·尾-1，增加了110.4%;相比于沒有經(jīng)過該菌劑處理的對照組（體重增加80.4%）增幅提高了30個百分點。由此可見，運用該配方培養(yǎng)的沼澤紅假單胞菌菌劑可有效減低水體的氨氮、亞硫酸鹽，減輕毒性，并增加水中溶解氧的量，有效改善水體環(huán)境，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量，可作為生態(tài)養(yǎng)殖的優(yōu)良改良劑。

3 結(jié)論與討論

關(guān)于沼澤紅假單胞菌的發(fā)酵配方優(yōu)化，已有較多文獻報道但所獲菌量偏低，如劉德海等[22]在沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化研究中，最終菌量為5.6×108 CFU·mL-1;劉昆等[23]在光合細菌生產(chǎn)配方的優(yōu)化研究中，活菌數(shù)可達12.5×108 CFU·mL-1;幸晶晶等[24]在沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究中，OD660值可達到2.186。并且已有的沼澤紅假單胞菌的發(fā)酵配方優(yōu)化文獻試驗方法相對單一，且對菌劑的放大培養(yǎng)及應(yīng)用涉及較少。如夏兵兵等[25]在沼澤紅假單胞菌發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化研究中，僅對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化;杜冰等[26]在沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)的研究中，僅使用單因素試驗對培養(yǎng)條件及配方進行分析;錢森和等[27]在紫色非硫光合細菌培養(yǎng)基條件優(yōu)化的研究中，僅對其配方優(yōu)化，未涉及菌劑的放大培養(yǎng)及應(yīng)用。

針對以上研究的不足，本研究首先運用單因素試驗對溫度、pH、接種量、光照發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化;然后篩選最佳的碳源、氮源、微量元素及無機鹽;最后運用Plackett-Burman設(shè)計及最陡爬坡試驗確定最佳配方。通過本研究最終使沼澤紅假單胞菌菌劑發(fā)酵菌量達到8.65×109 CFU·mL-1，遠超過現(xiàn)有已有相關(guān)報道的生產(chǎn)水平，最終確定其配方為檸檬酸1.0 g·L-1，牛肉膏1.8 g·L-1，酵母膏1.0 g·L-1，蛋白胨1.0 g·L-1，乙酸鈉1.0 g·L-1，硫酸鎂0.4 g·L-1，硫酸亞鐵8.0 mg·L-1，氯化鈣0.15 g·L-1，磷酸二氫鉀0.2 g·L-1，VB6 0.21 mg·L-1，復(fù)合無機鹽0.5 mL·L-1，pH 7.0。

此外，本研究還將優(yōu)化配方進行20 L放大培養(yǎng)，并將沼澤紅假單胞菌菌劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，取得了良好的效果，為沼澤紅假單胞菌大規(guī)模應(yīng)用提供了技術(shù)支持。然而，針對大型連續(xù)的生產(chǎn)，還需作進一步的探究與改良。

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收稿日期：2021-08-19

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（2016ZDJSD7A18）

作者簡介：楊傳倫（1981—），男，安徽蚌埠人，工程師，碩士，主要從事生物工程方面研究。

通訊作者簡介：楊丹丹（1989—），女，山東菏澤人，工程師，主要從事生物工程方面研究。