瞬時(shí)熱脅迫對(duì)秋季3種植物葉片光系統(tǒng)Ⅱ活性和色素含量的影響*

宋佳寶，劉煜光，周曉慧，趙丹，史寶勝

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000)

光系統(tǒng)活性是植物生長過程中的一項(xiàng)敏感指標(biāo)，葉綠素?zé)晒鈪?shù)能夠反映植物葉片的光合效應(yīng)以及熱耗散等情況，進(jìn)而有效評(píng)估逆境對(duì)光合作用損傷的相關(guān)機(jī)制[1]。熱脅迫是一項(xiàng)重要的環(huán)境脅迫因素，發(fā)生在整個(gè)光合機(jī)構(gòu)，阻礙線性電子及環(huán)式電子傳遞，導(dǎo)致植物光系統(tǒng)Ⅱ活性衰減，被不可逆損壞[2-3]。花色素苷是彩葉植物呈色的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，已有研究證明花色素苷能夠減弱過量ROS(活性氧自由基)的產(chǎn)生，保護(hù)處于逆境中植物的光合機(jī)構(gòu)[4]。

日本晚櫻(Cerasusserrulata)、日本櫻花(C.yedo-ensis)為薔薇科(Rosaceae)櫻屬(CerasusMill.)植物，紫葉矮櫻(Prunus×cistena)為薔薇科李屬(PrunusL.)植物，樹形優(yōu)美，花開絢麗，芳香四溢，在城鄉(xiāng)綠化美化、山地邊坡治理中應(yīng)用廣泛，具有極高的生態(tài)、觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，對(duì)于3種植物的研究主要集中在栽培繁殖技術(shù)[5]、生物學(xué)習(xí)性[6]、遺傳關(guān)系[7]等方面。前人對(duì)3種植物的耐旱性[8-9]、抗污染物能力[10]等已經(jīng)開展了豐富的研究，但主要集中在生化指標(biāo)的測定方面，葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合特性對(duì)熱脅迫的響應(yīng)規(guī)律未見報(bào)導(dǎo)。因此，本研究以日本晚櫻、日本櫻花及富含花色素苷的紫葉矮櫻為研究材料，采用人工控制熱脅迫溫度和時(shí)間，探討熱脅迫下3種植物葉片熒光特性和色素含量及其他生理指標(biāo)的變化情況和相關(guān)性，旨在揭示熱脅迫下其植物葉片光合響應(yīng)機(jī)制及花色素苷對(duì)熱脅迫傷害的協(xié)調(diào)保護(hù)機(jī)制，為耐熱優(yōu)質(zhì)品種選育提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)設(shè)在河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地位(38°48′26.13″N、115°24′58.30″E)，屬暖溫帶亞濕潤氣候，年平均氣溫12.7 ℃，年均降水量575.4 mm，年日照時(shí)數(shù)為2 560 h，年平均蒸發(fā)量1 760 mm，無霜期200 d，土壤類型為壤土，pH值7.6。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年9月底進(jìn)行。供試材料為7～8 a生生長良好、長勢一致的日本晚櫻、紫葉矮櫻、日本櫻花，每種植物選取3株植株，每株間距3 m。所選植株四周無高大喬木和灌木遮陰，土壤氣候條件一致。每植株采摘向陽主枝頂端起第4～8葉序葉片，取樣葉片須完全展開，且無病蟲害。采摘后，迅速置于濕毛巾中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將采摘的3種植物的葉片置于內(nèi)鋪濕潤濾紙的封口聚乙烯薄膜袋中，利用恒溫水浴鍋在完全避光條件下進(jìn)行加熱。測量溫度為(25±0.2)、(30±0.2)、(33±0.2)、(36±0.2)、(39±0.2)、(42±0.2)、(45±0.2)、(48±0.2)、(51±0.2)℃，將溫度計(jì)置于水中，使玻璃泡與葉片浸沒于同一高度，確保溫度的準(zhǔn)確性。處理時(shí)間為5、25、45 min。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

將不同處理下的葉片用葉夾進(jìn)行暗適應(yīng)30 min后，采用FluorPen手持式葉綠素?zé)晒鈨x(PSI，捷克)測定葉片快相葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線(OJIP)，測定時(shí)下鋪濕潤濾紙，盡可能減少葉片水分流失對(duì)葉片測定參數(shù)帶來的影響。每處理選取5個(gè)葉片的相應(yīng)位置打取葉圓片作為5次重復(fù)，記錄葉綠素?zé)晒鈪?shù)(表1)。

表1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)及含義

1.4.2 葉綠素含量的測定

熱脅迫處理后，每個(gè)處理每個(gè)重復(fù)均選取適量葉片，迅速擦凈、去主脈，然后剪碎混勻。每處理稱取0.1g葉片，3次重復(fù)。用95%乙醇作浸提液，置于暗處24h提取色素，用Thermo10S分光光度計(jì)(Cole-Parmer，美國)分別測定665、649、470nm處吸光值，用Arnon法修正公式計(jì)算葉綠素a(mg/g)、葉綠素b(mg/g)的含量[11]。

1.4.3 花色素苷含量的測定

花色素苷含量的測定按照Pirie等[12]的方法。稱取適量葉片，用體積比1%鹽酸甲醇溶液浸提，提取液分別于600、530、325、280nm處測定吸收值，以O(shè)D530～600 nm=0.1作1個(gè)單位，以U表示。

1.4.4 葉色的測定

采用全自動(dòng)色彩色差計(jì)CR-400(柯尼卡美能達(dá)，日本)每個(gè)處理重復(fù)測定3次。測定指標(biāo)包括L*、a*、b*，其中L*表示光澤明亮度；a*值表示色澤紅綠程度；b*的正值表示黃色程度。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

運(yùn)用Excel 2010和SPSS 26.0軟件對(duì)測定數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖及分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 瞬時(shí)熱脅迫對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.1.1 對(duì)初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)的影響

與25 ℃對(duì)照相比，5 min熱脅迫下紫葉矮櫻Fo值隨脅迫溫度的升高而不斷增加，51 ℃脅迫下的Fo值與CK差異顯著(P<0.05)(圖1A)；日本晚櫻、日本櫻花分別在48 ℃、51 ℃時(shí)差異達(dá)到顯著水平(圖1B、圖1C)。當(dāng)脅迫時(shí)間延長至25和45 min，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花Fo值開始顯著增加的溫度分別為48 、45 和45 ℃，與5 min熱脅迫處理相比均降低3 ℃。本試驗(yàn)中，熱脅迫提高了紫葉矮櫻、日本晚櫻葉片的Fo值，表明其葉片PS Ⅱ反應(yīng)中心遭到破壞，且破壞程度隨脅迫時(shí)間延長和脅迫溫度升高而增加。

圖1 不同熱脅迫處理3種植物Fo值的變化

隨著溫度的升高，紫葉矮櫻、日本晚櫻Fm值表現(xiàn)出先升后降的“單峰”變化趨勢(圖2A、2B)：與對(duì)照相比，紫葉矮櫻Fm值在36 ℃達(dá)到峰值，隨后又逐漸下降，最終降低至較低水平；日本晚櫻Fm值在33 ℃左右達(dá)到峰值，之后不斷降低，至42 ℃以上迅速降低。日本櫻花Fm值在熱脅迫下的變化則呈“上升(30 ℃)-下降(36 ℃)-上升(42 ℃)-下降(51 ℃)”的雙峰型曲線(圖2C)。Fm值可以反映PS Ⅱ電子傳遞情況。較高溫度的熱脅迫使3種試材Fm值顯著減小，表明高溫阻礙葉片中PS Ⅱ電子傳遞。

圖2 不同熱脅迫處理3種植物Fm值的變化

2.1.2 對(duì)最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響

熱脅迫5 min處理下，隨著溫度的升高3種試材的Fv/Fm值呈緩慢下降趨勢，至45 ℃以上Fv/Fm值迅速降低；脅迫時(shí)間延長至25 min和45 min，紫葉矮櫻、日本晚櫻的Fv/Fm值在溫度升高至45 ℃以上就迅速降低，日本櫻花在脅迫溫度達(dá)到39 ℃以上時(shí)Fv/Fm值迅速降低，與5 min相比均有所提前(圖3)。可見，45 ℃以上的瞬時(shí)熱脅迫會(huì)顯著降低3種試材PS Ⅱ原初光能化學(xué)轉(zhuǎn)換率。

圖3 不同熱脅迫處理3種植物Fv/Fm的變化

2.1.3 對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心活性參數(shù)的影響

由表2可知，5 min和25 min的較短時(shí)間脅迫下，與25 ℃對(duì)照相比，39～51 ℃的高溫處理使3種植物的ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC值顯著升高，而在45 min較長時(shí)間的51 ℃高溫脅迫下3種植物的ETO/RC值顯著降低。25 min和45 min脅迫時(shí)間下ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC、ETO/RC值發(fā)生顯著變化時(shí)的溫度(39～42 ℃)與5 min脅迫時(shí)間下(45～51 ℃)相比有所提前，幅度為3～6 ℃。最高熱脅迫溫度和最長熱脅迫時(shí)間組合處理下，與對(duì)照相比，紫葉矮櫻的ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC值變幅最小，日本晚櫻的ETO/RC值變幅最大。

表2 不同熱脅迫處理3種植物PSⅡ反應(yīng)中心活性參數(shù)的變化

2.1.4 對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ能量分配比率的影響

由圖4可知：隨著熱脅迫溫度的升高，經(jīng)45～51 ℃高溫處理后的3種植物葉片φPo值顯著下降、φDo值顯著增加；φEo隨著脅迫溫度升高呈降低、升高再降低的趨勢，脅迫程度最大，即51 ℃高溫處理45 min時(shí)的值顯著低于對(duì)照值，分別降低41.6%、77.0%、67.0%；隨溫度增加，日本晚櫻ψo(hù)先降低后升高，日本櫻花和紫葉矮櫻ψo(hù)值先升高后降低，經(jīng)51 ℃熱脅迫后，3種植物ψo(hù)值均顯著低于對(duì)照，降幅為19.8%、65.3%、32.5%。這表明，高溫脅迫下，葉片光系統(tǒng)通過增加熱耗散、調(diào)節(jié)PSⅡ能量分配比率以適應(yīng)熱脅迫。

圖4 不同熱脅迫處理3種植物葉片PSⅡ能量分配比率的變化

2.2 瞬時(shí)熱脅迫對(duì)葉綠素含量的影響

隨著熱脅迫溫度的升高，與25 ℃(對(duì)照)相比，5 min熱脅迫時(shí)間處理下，紫葉矮櫻的葉綠素含量呈現(xiàn)先緩慢上升再顯著下降的趨勢(圖5A)，日本晚櫻和日本櫻花的葉綠素含量表現(xiàn)為下降趨勢(圖5B、圖5C)，經(jīng)33 ℃的熱脅迫后，3種植物葉片葉綠素含量與對(duì)照相比均顯著降低；脅迫時(shí)間延長20 min后，紫葉矮櫻葉綠素含量先波動(dòng)變化(25～36 ℃)再顯著降低，日本晚櫻和日本櫻花的葉綠素含量逐漸降低；45 min的熱脅迫下，日本晚櫻和日本櫻花經(jīng)過30 ℃熱脅迫后的葉綠素含量與對(duì)照相比顯著降低(P<0.05)，紫葉矮櫻發(fā)生這個(gè)過程的溫度為33 ℃，與其他2種櫻花相比溫度有所升高。最高熱脅迫溫度和最長熱脅迫時(shí)間組合處理下，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花葉綠素含量較對(duì)照分別降低44.5%、70.3%、69.2%，試驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)高溫?zé)崦{迫后紫葉矮櫻葉片的葉綠素含量降低的幅度最小。

圖5 不同熱脅迫處理3種植物葉綠素含量的變化

熱脅迫下，3種植物葉綠素a、葉綠素b含量逐漸減少，隨著脅迫溫度的升高和脅迫時(shí)間的增加，3種植物葉綠素a/b含量總體呈升高趨勢，溫度達(dá)到45～51 ℃，3種植物經(jīng)歷一個(gè)先降后增的過程(圖6)。5 min熱脅迫時(shí)間處理下，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花葉綠素a/b值出現(xiàn)降低情況的溫度為51 ℃、51 ℃、42 ℃；25 min處理下的拐點(diǎn)溫度分別為51 ℃、45 ℃、45 ℃；45 min處理下則提前至48 ℃、45 ℃、42 ℃。51 ℃處理下3種植物葉綠素a/b分別增加23.2%、30.7%、45.5%，紫葉矮櫻增幅最小。

圖6 不同熱脅迫處理3種植物葉綠素a含量/葉綠素b含量的變化

2.3 瞬時(shí)熱脅迫對(duì)葉片花色素苷含量的影響

同一脅迫時(shí)間下，3種植物葉片花色素苷含量隨溫度的升高而減少；同一溫度下，花色素苷含量隨時(shí)間延長而減少(圖7)。當(dāng)脅迫程度達(dá)到最大，即脅迫溫度為51 ℃、脅迫時(shí)間為45 min時(shí)，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花花色素苷含量分別為對(duì)照的66.6%、17.3%、16.7%。這說明高溫在一定程度上影響3種植物葉片中花色素苷的合成或分解，而紫葉矮櫻的花色素苷熱穩(wěn)定性最高。

圖7 不同熱脅迫處理3種植物花色素苷含量的變化

2.4 瞬時(shí)熱脅迫對(duì)3種植物葉色的影響

隨熱脅迫溫度的升高和熱脅迫時(shí)間的延長，3種植物葉片L*逐漸降低，a*值逐漸增加，b*值有所降低(表3)。當(dāng)熱脅迫程度達(dá)到最大(51 ℃、45 min組合處理)時(shí)，與對(duì)照相比，日本晚櫻、紫葉矮櫻、日本櫻花L*值分別降低19.81%、10.06%、11.17%，a*值分別增加31.15%、25.57%、48.73%，b*值分別降低56.69%、3.08%、25.4%。表明高溫能夠降低3種植物葉片的亮度，提高葉片紅綠比值，降低黃藍(lán)比值，使呈色偏向紅色。3種植物中，紫葉矮櫻葉色參數(shù)的變化最小。

3 討論

3.1 瞬時(shí)高溫脅迫誘導(dǎo)植物光系統(tǒng)活性的降低

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是在生理生化水平上了解熱脅迫和熱脅迫耐受性的重要指標(biāo)。植物PS Ⅱ?qū)δ婢趁{迫非常敏感，在植物正常生理?xiàng)l件下，其潛在的PS Ⅱ光化學(xué)效率Fv/Fm變化很小，而逆境條件下該參數(shù)則會(huì)明顯降低[13]。已有研究結(jié)果表明，高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉片F(xiàn)o增加，F(xiàn)m、Fv/Fm顯著下降[14]。本研究與上述結(jié)果一致。說明PS Ⅱ反應(yīng)中心及放氧復(fù)合體OEC受高溫影響失活，抑制QA向QB的電子傳遞，受體側(cè)電子QA不斷積累，PS Ⅱ穩(wěn)定性降低，進(jìn)而影響植物的光合功能[15-16]。此外發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v/Fm在受到較低溫度(25～45 ℃)的熱脅迫和高溫?zé)崦{迫(45 ℃以上)時(shí)下降程度不一，45 ℃以后顯著下降，推測3種植物在受到45 ℃以下的較低溫度脅迫時(shí)，能夠通過調(diào)節(jié)補(bǔ)光天線系統(tǒng)的方式減少PS Ⅱ供給側(cè)激發(fā)能的積累或利用其他方式來減少光系統(tǒng)傷害程度；在高溫?zé)崦{迫逆境下，葉綠素穩(wěn)定性遭到破壞，電子傳遞鏈?zhǔn)軗p，光化學(xué)效率降低以配合CO2同化能力的降低，PS Ⅱ受到破壞。日本櫻花經(jīng)過連續(xù)45 min的48 ℃的熱脅迫后，φPo、Fv/Fm降為0，與油菜(BrassicanapusL.)經(jīng)高溫脅迫后的結(jié)果一致[17]，進(jìn)一步說明重度高溫脅迫致使葉片光系統(tǒng)Ⅱ發(fā)生不可逆損害。

表3 不同熱脅迫處理下3種植物L(fēng)*、a*、b*的變化

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種植物在受短暫高溫脅迫后比活性參數(shù)與初始值無顯著差異，說明它們通過調(diào)節(jié)自身對(duì)光能的吸收、捕獲、傳遞和耗散，最終獲得較高的光能轉(zhuǎn)換能力，PS Ⅱ活動(dòng)能夠正常進(jìn)行[18]。ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC值在最大熱脅迫程度下迅速升至高水平，可能是因?yàn)殚L時(shí)間(45 min)的高溫(51 ℃)處理致使3種植物因熱耗散不足而導(dǎo)致光能過剩，使得PS Ⅱ產(chǎn)生光抑制，光合機(jī)構(gòu)被不可逆的損壞。而φDo升高，說明3種植物葉片通過提高熱耗散將過剩的光能散失，從而達(dá)到降低高溫傷害的目的，這也是3種植物自我保護(hù)的體現(xiàn)。隨高溫脅迫時(shí)間的增加，葉片φEo下降，說明高溫使QA傳遞受阻。當(dāng)脅迫溫度超過45 ℃，這3種植物的φEo閾值存在差異，紫葉矮櫻明顯更低，說明其電子傳遞能力更強(qiáng)，光合效率更高。

3.2 花色素苷對(duì)光系統(tǒng)具有保護(hù)作用

不同植物對(duì)熱脅迫處理的生理反應(yīng)明顯不同。紫葉矮櫻的Fo值及變幅、Fv/Fm的降幅最小，說明其耐熱性較高，這可能與花色素苷的保護(hù)作用有關(guān)，即當(dāng)植物葉片吸收光能出現(xiàn)過剩時(shí)，葉片中大量的花色素苷可以通過吸收和過濾藍(lán)紫光，減輕葉片光抑制和光氧化傷害程度[19]。張會(huì)慧等研究證明，花色素苷能夠改變丁香葉片吸收和利用光能的途徑及耗散過剩光能的方式[20]。富含花色素苷的紫葉矮櫻的ABS/RC、ETo/RC、TRo/RC和DIo/RC低于花色素苷含量較低的日本晚櫻和日本櫻花，由此推測：紫葉矮櫻葉片因花色素苷的大量存在而減輕吸收的光能，對(duì)緩解高溫對(duì)PS Ⅱ反應(yīng)中心的破壞具有積極作用。

高等植物光系統(tǒng)Ⅱ的補(bǔ)光天線(LHCⅡ b)是捕光色素蛋白復(fù)合物，代表葉綠素b向葉綠素a的能量傳遞，高溫使LHCⅡ b穩(wěn)定性降低，葉綠素a/b增加[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫葉矮櫻葉綠素a/b的的變幅最小，可能是因?yàn)槠淙~片中存在大量的花色素苷，能夠減少高溫對(duì)LHCⅡ的影響，進(jìn)而使葉綠素a/b增加速度減緩[23]。這也印證了紫葉矮櫻耐熱性優(yōu)于日本晚櫻和日本櫻花的說法。

總的來說，紫葉矮櫻葉片中較高含量的花色素苷可改變其對(duì)光能的吸收，從而具有有效緩解熱脅迫造成的光抑制、減輕熱脅迫對(duì)葉片光合機(jī)構(gòu)尤其是PS Ⅱ反應(yīng)中心的傷害、降低對(duì)細(xì)胞中葉綠素的破壞程度、保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的作用，這可能是紫葉矮櫻對(duì)高溫?zé)崦{迫具有較強(qiáng)抗性的原因之一。