郭 磊 田 野 高 然 孔德仙 王軍民 華 燕

（1. 西南林業(yè)大學(xué)云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650233）

植物揮發(fā)油是植物體內(nèi)的次生代謝物，由相對(duì)分子質(zhì)量較小的簡(jiǎn)單化合物組成，具有一定的消炎、抗氧化及抑制病蟲害等多種生物活性[1-2]，具有極大的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值，也是藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

樺褶孔菌（Lenzites betulina）是屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycete）、傘菌綱（Agaricomycetes）、多孔菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）、褶孔菌屬（Lenzites）的一種大型真菌，通常生在樺樹倒木上，在中國(guó)有著廣泛分布[3-4]。樺褶孔菌含有多種生理活性物質(zhì)，比如多糖、吡喃酮、甾醇等[5-7]，已被用于臀部和股骨疼痛、肩高病、中風(fēng)和感冒疾病的治療[8]。目前，對(duì)樺褶孔菌的研究較少，只是在子實(shí)體中多糖的分離純化及化合物的分離鑒定方面有較少的報(bào)道，對(duì)其揮發(fā)油化學(xué)成分及其生物活性研究還處于空白階段。因此，本研究以樺褶孔菌子實(shí)體為原料，通過超臨界CO2萃取技術(shù)并結(jié)合GC?MS對(duì)揮發(fā)油的化學(xué)組成進(jìn)行鑒定；同時(shí)，測(cè)定揮發(fā)油對(duì)DPPH·、O2?·、·OH和ABTS+·的清除能力及抑菌活性，以期為樺褶孔菌資源的綜合利用和深度開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褶孔菌子實(shí)體購(gòu)自深圳悅云商貿(mào)有限公司，由西南林業(yè)大學(xué)張穎博士鑒定為樺褶孔菌，標(biāo)本保存于西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院植物資源利用系。菌種由西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)與利用學(xué)院和西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，分別為大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）、變形桿菌（Proteus vulgaris）、金黃色葡萄球菌金黃亞種（Staphylococcus aureus subsp. aureus）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

1,1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH）、2,2'?聯(lián)氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸（ABTS），正己烷、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、焦性沒食子酸、抗壞血酸、二甲基亞砜（DMSO），均為分析純；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂，氯化鈉，均為試劑純。

1.2 儀器與設(shè)備

Speed SFE超臨界萃取儀（ASI，美國(guó)）；7890A?5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent，美國(guó)）；UV?VIS 300紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher，美國(guó)）；BAS2245電子天平（Strtorius，德國(guó)，精度0.1 mg）；HH?2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（金壇市丹瑞電器廠，中國(guó)）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海秋佐科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超臨界CO2萃取樺褶孔菌揮發(fā)油

稱取30 g樺褶孔菌干燥粉末裝入超臨界CO2萃取儀萃取釜內(nèi)，設(shè)置萃取壓力25 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)間2 h；靜態(tài)萃取后在CO2流量10 L/h條件下連續(xù)萃取0.5 h，用正己烷收集得到有特殊香味的黃色油狀物。

1.3.2 樺褶孔菌揮發(fā)油GC-MS分析

GC條件：DB?5 MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m ×0.25 mm × 0.25 μm）；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；采用程序升溫，進(jìn)樣口溫度250 ℃，初始溫度80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升至260 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 速率升至280 ℃，保持6 min；再以5 ℃/min速率升至310 ℃，保持10 min；采用無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1.0 μL。MS條件：EI離子源；離子源溫度240 ℃；接口溫度280 ℃; 電子能量70 eV；溶劑延時(shí)4.5 min；掃描方式：全譜圖掃描; 質(zhì)量掃描范圍50～600 amu。

1.3.3 樺褶孔菌揮發(fā)油抗氧化活能力測(cè)定

1）清除DPPH·能力參照曾昭成等[9]的方法并略作修改，將樺褶孔菌揮發(fā)油溶于DMSO配成6.25、12.5、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL濃度的溶液，量取2.0 mL樣液加入2.0 mL DPPH?乙醇溶液（0.2 m moL）搖勻后靜置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光值（A1）。以等體積無水乙醇代替DPPH?乙醇溶液測(cè)吸光值（A2），以等體積無水乙醇代替樣液測(cè)吸光值（A0），以維生素C為對(duì)照， 每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。按公式（1）計(jì)算樺褶孔菌揮發(fā)油清除DPPH·清除率。

2）清除O2?·能力的測(cè)定采用鄰苯三酚法[10]，取3.0 mL Tris?HCl緩沖液（pH 8.2）加入1 mL 6.25、12.5、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL濃度的樺褶孔菌揮發(fā)油溶液和0.4 mL鄰苯三酚溶液（5.0 mmol/L）搖勻，在25 ℃水浴中放置4 min后，立即加入0.1 mL HCl溶液（8.0 mol/L）終止反應(yīng)，在320 nm處測(cè)定吸光度（As），以等體積蒸餾水代替樣液測(cè)吸光值（Ac），以等體積蒸餾水代替鄰苯三酚測(cè)定吸光值（Ab），以維生素C為對(duì)照， 每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，按公式（2）計(jì)算O2?·清除率。

3）清除·OH能力參照Wannes等[11]的方法并略作修改，取不同濃度的樺褶孔菌揮發(fā)油（6.25、12.5、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL）2.0 mL，依次加入3 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水楊酸?乙醇溶液和4 mmol/L H2O2溶液各0.2 mL，搖勻靜置60 min后在510 nm下測(cè)吸光值（Aα）。以等體積蒸餾水代替水楊酸測(cè)吸光值（Aβ），以等體積蒸餾水代替樣液測(cè)吸光值（Aγ）。以維生素C為對(duì)照，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，按公式（3）計(jì)算·OH清除率。

4）清除ABTS+·能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]并適 當(dāng) 修 改，將2.45 mmol·L?1過 硫 酸 鉀 溶 液 與7 mmol/L ABTS溶液混合（體積比為1∶1）并避光放置12 h后，用無水乙醇將其稀釋，使其吸光值在734 nm 處為0.68 ～ 0.72之間，取3.0 mL混合液與0.3 mL揮發(fā)油樣液于室溫下反應(yīng)6 min后，迅速在734 nm處測(cè)定吸光度值（Ai） ，以等體積蒸餾水代替儲(chǔ)備液測(cè)吸光值（Aii），以等體積蒸餾水代替樣液測(cè)定吸光值（Aiii）。以維生素C為對(duì)照，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，按公式（4）計(jì)算ABTS+·清除率。

1.3.4 樺褶孔菌揮發(fā)油抑菌活性測(cè)定

1）菌種培養(yǎng) 抗菌試驗(yàn)菌株為3種革蘭氏陰性菌如大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomanas aeruginosa）和變形桿菌（Proteus vuigaris），3種革蘭氏陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌金黃亞種（Staphylococcus aureussubsp. aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）。菌種培養(yǎng)采用馮小飛等[13]方法并略作修改，將固體瓊脂培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌20 min后平鋪于培養(yǎng)皿，用劃線法接種這6種細(xì)菌，將培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，所有操作均在無菌條件下操作。

2）最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定參照李肖等[14]方法并略作修改。精確稱量樺褶孔菌揮發(fā)油并用DMSO配制成不同濃度的初始液，并用二倍稀釋法再進(jìn)行配制。具體操作如下：在無菌96孔板中，第1列至第6列為樣品孔，第7列為空白對(duì)照孔，第8列為陽(yáng)性對(duì)照孔，每孔加入100 μL液體培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入50 μL的樣品溶液，利用二倍稀釋法使第1至6列的濃度梯度為100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL，空白對(duì)照加入50 μL DMSO，陽(yáng)性對(duì)照組加入50 μL鏈霉素溶液（0.1 g/L）。在每孔中加入50 μL菌液置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，平行測(cè)定3次，加入40 μL碘硝基四唑紫溶液（0.2 g/L），觀察微孔中是否出現(xiàn)紫色來檢查有無細(xì)菌生長(zhǎng)，以不出現(xiàn)紫色的微孔濃度為MIC。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3次，使用Origin Pro 2017 C對(duì)試驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SPSS Statistics 20對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油化學(xué)成分分析

由表1可知，從樺褶孔菌揮發(fā)油中鑒定出31種化合物，主要化學(xué)成分有亞油酸（12.9%）、三十四烷（9.4%）、二十四烷（6.4%）、抗壞血酸二棕櫚酸酯（4.5%）、9（11）?脫氫麥角甾醇苯甲酸酯（3.2%）、二十烷（2.3%）、二十一烷（2.3%）、2,4?二叔丁基苯酚（2.2%）、二（6?甲基庚基）鄰苯二甲酸酯（1.8%）、3,6?二羥基膽烷酸（1.7%）、4?硝基苯基壬醚（1.6%）、2,6,10,14?四甲基十八烷（1.5%）、5?（2?甲基丙基）壬烷（1.4%）、5?丁基?壬烷（1.4%）、四十四烷（1.4%）、2?甲基十七烷（1.4%）、2,2?二甲基癸烷（1.3%）和2?苯?2?丁烯（1.2%）。

表1 樺褶孔菌揮發(fā)油的化學(xué)成分分析Table 1 The chemical constituents of volatile oil from L. betulina

2.2 樺褶孔菌揮發(fā)油抗氧化活性

2.2.1 樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除作用

由圖1可知，樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除能力在濃度為6.25～500 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。當(dāng)濃度為500 μg/mL時(shí)，樺褶孔菌揮發(fā)油和維生素C對(duì)DPPH·的清除率分別達(dá)到了（81.11 ± 0.15）%和（95.44 ± 0.15）%。相同濃度條件下，樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除能力低于維生素C。表2是用Probit函數(shù)進(jìn)行回歸計(jì)算樺褶孔菌揮發(fā)油和維生素C抗氧化活性的EC50值，從表中可以看出樺褶孔菌揮發(fā)油清除DPPH·的EC50值為（115.81 ± 4.75）μg/mL，低于維生素C清除DPPH·的EC50值（16.74 ± 2.82）μg/mL。

表 2 樺褶孔菌揮發(fā)油抗氧化活性的EC50值Table 2 EC50 of volatile oils from L. betulina μg/mL

圖1 樺褶孔菌揮發(fā)油濃度對(duì)DPPH·的清除效果影響Fig. 1 DPPH· free radical scavenging capacity of volatile oils from L. betulina

2.2.2 樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)O2?·的清除作用

由圖2可知，樺褶孔菌揮發(fā)油和維生素C清除O2?·能力的強(qiáng)弱，樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)O2?·的清除能力在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)與濃度呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。相同濃度下，樺褶孔菌揮發(fā)油清除O2?·的能力低于維生素C。樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)O2?·的清除率在濃度為100～500 μg/mL范圍迅速上升，當(dāng)濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)，樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)O2?·的清除能力達(dá)到（87.97 ± 1.84）%，此時(shí)維生素C的清除能力為（98.28 ± 1.29）%。由表2可知，樺褶孔菌揮發(fā)油清除O2?·的EC50值為（40.72 ±3.71）μg/mL，略高于維生素C（5.39 ± 1.69）μg/mL。

圖2 樺褶孔菌揮發(fā)油濃度對(duì)O2?·清除效果的影響Fig. 2 Superoxide anion free radical scavenging capacity of volatile oils from L. betulina

2.2.3 樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)·OH的清除作用

由圖3可知，在濃度為6.25～50 μg/mL之間，樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)·OH的清除能力遠(yuǎn)高于維生素C，當(dāng)濃度為50 μg/mL時(shí)，樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)·OH的清除率為（42.98 ± 2.79）%，而此時(shí)維生素C的清除率僅有（7.33 ± 0.90）%。隨著樣品濃度的增加，樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)·OH的清除率明顯低于維生素C。當(dāng)濃度為500 μg/mL時(shí)，樺褶孔菌揮發(fā)油的清除率為（65.58 ± 4.84）%，低于相同濃度的維生素C（99.59 ± 0.20%）。由表2可知，樺褶孔菌揮發(fā)油清除·OH的EC50值為（185.26 ± 5.22）μg/mL，高于維生素C的EC50（71.96 ± 4.28）μg/mL。

圖3 樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)·OH的清除效果影響Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging capacity of volatile oils from L. betulina

2.2.4 樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)ABTS+·的清除作用

由圖4可知，樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)ABTS+·的清除率為2.94%～47.70%，且清除能力隨濃度的增加而增大。在6.25～25 μg/mL范圍內(nèi)，樺褶孔菌揮發(fā)油和維生素C對(duì)ABTS+·的清除率相差不大，但濃度在50～500 μg/mL的增長(zhǎng)過程中，維生素C對(duì)ABTS+·的清除率明顯高于樺褶孔菌揮發(fā)油。從對(duì)ABTS+·的EC50值來看，樺褶孔菌揮發(fā)油的EC50為（687.63 ± 6.53）μg/mL，遠(yuǎn)高于Vc的EC50值（45.93 ± 3.83）μg/mL。

圖4 樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)ABTS+·的清除作用Fig. 4 ABTS+· free radical scavenging capacity of volatile oils from L. betulina

2.3 樺褶孔菌揮發(fā)油的抑菌活性

由表3可知，樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)6種細(xì)菌均具有一定的抑菌效果，尤其對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC值達(dá)到3.91 μg/mL。樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)6種細(xì)菌的抑制強(qiáng)度大小為 枯草芽孢桿菌>變形桿菌=大腸桿菌>四聯(lián)球菌>銅綠假單胞菌=金黃色葡萄球菌金黃亞種。

表3 樺褶孔菌揮發(fā)油抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Antibacterial test results of volatile oil from L. betulina

3 結(jié)論與討論

本研究首次用GC?MS從樺褶孔菌揮發(fā)油中鑒定出31種化合物，包括19種烴類化合物、5種酯類化合物、2種脂肪酸類化合物、2種芳香族化合物、1種酚類化合物、1種烯烴類化合物和1種醚類化合物。亞油酸是揮發(fā)油中含量最高的，達(dá)到12.9%，其余含量較多的化合物為二十四烷（6.4%）、抗壞血酸二棕櫚酸酯（4.5%）、9（11）?脫氫麥角甾醇苯甲酸酯（3.2%）、二十烷（2.3%）、二十一烷（2.3%）、2,4?二叔丁基苯酚（2.2%）、二（6?甲基庚基）鄰苯二甲酸酯（1.8%）、3,6?二羥基膽烷酸（1.7%）、4?硝基苯基壬醚（1.6%）、2,6,10,14?四甲基十八烷（1.5%）、5?（2?甲基丙基）壬烷（1.4%）、5?丁基?壬烷（1.4%）、四十四烷（1.4%）、2?甲基十七烷（1.4%）、2,2?二甲基癸烷（1.3%）和2?苯?2?丁烯（1.2%）。

樺褶孔菌揮發(fā)油的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，其對(duì)DPPH·、O2?·、·OH和ABTS+·均具有較強(qiáng)的清除能力，且清除率與揮發(fā)油濃度間較好呈量效關(guān)系；樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)4種自由基清除率的EC50值分別為（115.81 ± 4.75）、（40.72 ± 3.71）、（185.26 ±5.22）、（687.63 ± 6.53）μg/mL，其中樺褶孔菌揮發(fā)油和維生素C對(duì)O2?·清除率的EC50值（5.39 ±1.69）μg/mL接近，遠(yuǎn)低于瞿麥揮發(fā)油和馬尾松松針揮發(fā)油的EC50值。此外，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明樺褶孔菌揮發(fā)油對(duì)多種細(xì)菌均具有較好的抑制效果，尤其對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果最佳（MIC僅為3.91 μg/mL）。研究結(jié)果表明樺褶孔菌揮發(fā)油具有作為天然抗氧化劑和抑菌劑的潛力，同時(shí)也為樺褶孔菌資源的綜合開發(fā)與利用提供了數(shù)據(jù)支持。