馬翔，李輝，郭霄，李明燕，柳健, 李有，劉慶超，王奎玲，劉慶華

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東青島 266109；2. 濟(jì)南市林場，山東濟(jì)南 250100)

人類社會的發(fā)展與進(jìn)步將會使得全球范圍內(nèi)的活性氮排量持續(xù)增加[1-3]，氮的排放和沉積率到2050年將增加一倍，全球氮沉降量將達(dá)到1.9×108t·a-1。氮沉降增加一是使土壤內(nèi)的氮含量增加[4]；二是由于降水的不均衡性，導(dǎo)致了不同地區(qū)的氮素資源異質(zhì)性[5]。氮沉降對植物的影響具有兩面性，一方面氮沉降有利于植物的生長發(fā)育[4]，保證了植物生長發(fā)育所需的氮素營養(yǎng)物質(zhì)的充足，促進(jìn)植物光合作用，提高生產(chǎn)力[1, 6-8]；另一方面，氮元素過多會抑制植物的生長發(fā)育和各項生理活動，例如破壞植物細(xì)胞的膜組織，造成植物養(yǎng)分失衡，高滲透壓會導(dǎo)致植物失水過多，甚至?xí)怪仓旮煽菟劳鯷3-4, 9]。資源異質(zhì)性會使生態(tài)系統(tǒng)中各部分獲取的資源變得不均衡，原有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會受到破壞，降低生物量和生物多樣性。目前已有大量圍繞養(yǎng)分空間異質(zhì)性而展開的試驗研究，有的研究表明養(yǎng)分空間異質(zhì)性不僅能影響生物的總生物量，還會影響生物對生物量的分配[10]。

耐冬山茶[Camelliajaponica(NaiDong)]，山茶科山茶屬常綠闊葉灌木或小喬木，是分布于膠東半島地區(qū)的一個山茶原生種群[4]，因其花在最嚴(yán)寒時節(jié)綻放，被當(dāng)?shù)胤Q之為“耐冬山茶”。茶梅(Camelliasasanqua)，山茶科山茶屬常綠灌木或小喬木，主要分布于中國和日本西南部，花芳香，花期長，花期自10月下旬至來年4月，是山茶屬中四大觀賞栽培類群之一[11]。耐冬山茶和茶梅因具有極高的觀賞價值而被廣泛應(yīng)用于園林綠化當(dāng)中。前人對耐冬山茶和茶梅的研究大多集中在種質(zhì)資源、品種分類、雜交育種等方面，關(guān)于氮沉降和時間異質(zhì)性的研究較少。本文以耐冬山茶和茶梅為研究對象，分析不同氮沉降脅迫下耐冬山茶和茶梅的生理生態(tài)學(xué)適應(yīng)機(jī)制，為今后耐冬山茶和茶梅的資源開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究對象為1年生耐冬山茶和茶梅實生苗。7月于青島市植物園采集種子，12月至來年3月將種子沙藏催芽，3月初種植于花盆(高15 cm、直徑15 cm)中，栽培基質(zhì)是經(jīng)過充分混合的相同體積的草炭和沙土。6月初，對長勢正常的幼苗進(jìn)行篩選，耐冬山茶幼苗和茶梅幼苗各自篩選出63盆，每7盆為1組。

1.2 試驗設(shè)計

2018年夏季在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行試驗。設(shè)置3個氮沉降量和3個氮沉降添加頻率，3個氮沉降量分別為N0對照組(0 g·m-2·a-1)、N1輕度氮沉降(6 g·m-2·a-1)、N2重度氮沉降(12 g·m-2·a-1)[4]；3個不同氮沉降量使用的添加液的成分和濃度見表1。3個氮沉降添加頻率分別為F1高添加頻率(6 d添加一次)、F2中添加頻率(12 d添加一次)、F3低添加頻率(18 d添加一次)。耐冬山茶幼苗和茶梅幼苗各9個處理組，每組7個重復(fù)，試驗處理時間共計108 d。整個試驗過程中，保證室溫均衡一致且通風(fēng)良好，及時進(jìn)行正常的養(yǎng)護(hù)管理工作，防止夏季經(jīng)常出現(xiàn)的多風(fēng)多雨天氣的影響，避免雜草、病蟲害等發(fā)生。

表1 3個不同氮沉降量使用的添加液的成分和濃度表Table 1 Composition and concentration table of additive solutions used at three different nitrogen settlement

1.3 試驗指標(biāo)的測定[12]

1.3.1 生長指標(biāo)的測定

在最后一次添加氮沉降處理溶液的7 d后對耐冬山茶幼苗和茶梅幼苗的株高(H)、基徑(BD)和冠面積(SCA)等生長指標(biāo)進(jìn)行測量。冠面積采用Li等[2]所述的公式測量并計算。

SCA=a×b×0.25π

其中：a為每株幼苗最大伸展處測量所得冠幅長,cm;b為在其平面垂直方向測量所得冠幅寬,cm。

比葉面積測定：每株植株摘取完全展開的健康成熟葉片1片，用便攜式葉面積儀Yaxin-1241(北京雅欣理儀科技有限公司)測量葉片面積(SLA)并記錄。最后將葉片放入烘箱中用85 ℃烘48 h使其完全脫水后稱量其干質(zhì)量(MLDW)。根據(jù)公式計算比葉面積(SLA)：

SLA=SLA/MLDW× 100%[2]

生物量的測定：將試驗所用的全部的耐冬山茶幼苗和茶梅幼苗整株挖出，切割分解為根、莖、葉三部分，分別放入烘箱中80 ℃烘48 h，最后使用電子天平各自稱量根、莖、葉三部分的質(zhì)量并記錄，根據(jù)以下公式計算生物量的分配[3]：

總生物量MTB=MRB+MSB+MLB；

根生物量比(RMR)=MRB/MTB；

葉生物量比(LMR)=MLB/MTB；

根冠比(RS)=MRB/ (MLB+MSB)

其中：MRB根生物量，MTB總生物量，MLB葉生物量，MSB莖生物量。

1.3.2 生理指標(biāo)的測定

氣體交換參數(shù)測定：使用便攜式光合儀CIRAS-3(漢莎科學(xué)儀器有限公司，UK)對植株葉片的凈光合速率(Pn)、細(xì)胞間隙CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(E)、氣孔導(dǎo)度(Gs)等值進(jìn)行測量，測量時的參數(shù)設(shè)置為光強(qiáng) 1 000 μmol·m-2·s-1，葉室溫度 27 ℃，濕度為 60%， CO2濃度為 400 μmol·mol-1。并根據(jù)公式計算氣孔限制值(LS)：

LS=1-Ci /Ca，(Ca為空氣CO2濃度)，

葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定：使用植物效率分析儀Pocket PEA(漢莎科學(xué)儀器有限公司，UK)對植株葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測量[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2019整理數(shù)據(jù)，釆用SPSS 21對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗后進(jìn)行單因素和雙因素的ANOVA分析，比較各個參數(shù)分別在不同氮沉降量和氮沉降添加頻率條件下的差異，以及兩因素間是否存在交互作用。存在顯著差異之后進(jìn)行鄧肯(Duncan)多重比較(α=0.05)，并用字母進(jìn)行標(biāo)記。

2 結(jié)果分析

2.1 耐冬山茶和茶梅的生長指標(biāo)對不同氮沉降的響應(yīng)

由表2可以看出，氮沉降和添加頻率及二者的交互作用，對耐冬山茶的生長指標(biāo)無影響，而對茶梅的冠面積影響極顯著。由圖1可知，茶梅的株高在重度氮沉降和低添加頻率的條件下達(dá)到最大值(9.57 cm)，相較于相同氮沉降水平下的高添加頻率和中添加頻率，分別提高了15.7%和7.5%；氮沉降對茶梅基徑的影響不顯著；茶梅冠面積受氮沉降的影響顯著，加氮組的茶梅冠面積低于對照組。

圖1 氮沉降量和氮沉降添加頻率的改變對植株生長指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of nitrogen deposition rate and nitrogen deposition frequency on growth parameter of plant

表2 氮沉降量和添加頻率對耐冬山茶和茶梅的生長指標(biāo)影響的雙因素方差分析Table 2 Two-way ANOVA of the effects of nitrogen deposition rate and addition frequency on the growth indicators of Camellia japonica(NaiDong) and Camellia sasanqua

2.2 耐冬山茶和茶梅的生物量對不同氮沉降的響應(yīng)

耐冬山茶幼苗的生物量不受氮沉降和添加頻率及兩者交互作用處理的影響，而茶梅幼苗的葉生物量(MLB)和總生物量(MTB)在不同添加頻率的作用下差異顯著，其他因素對茶梅生物量的影響均不顯著(表3)。在輕度氮沉降和重度氮沉降處理下茶梅的MLB、MTB都隨著添加頻率的提高而升高(圖2)。

圖2 氮沉降量和氮沉降添加頻率的改變對植株生物量的影響Fig. 2 Effects of nitrogen deposition rate and nitrogen deposition frequency on biomass parameters of plant

表3 氮沉降量和添加頻率對耐冬山茶和茶梅的生物量影響的雙因素方差分析Table 3 Two-way ANOVA of the effects of nitrogen deposition rate and addition frequency on biomass of Camellia japonica(NaiDong) and Camellia sasanqua

2.3 耐冬山茶和茶梅的生物量比對不同氮沉降的響應(yīng)

由表4可知，添加頻率極顯著地影響了茶梅的根生物量比(RMR)，氮沉降量對茶梅幼苗的根冠比(RS)影響顯著。添加頻率對耐冬山茶幼苗的RMR也有顯著影響。在相同的添加頻率下，茶梅幼苗在輕度氮沉降量處理組下的RS均為最低值；在相同氮沉降處理下，低添加頻率茶梅幼苗的RMR均達(dá)到最高值。耐冬山茶在各個氮沉降量處理下，RMR均在中添加頻率時達(dá)到最大值(圖3)，分別為0.61、0.46、0.77。

表4 氮沉降量和添加頻率對耐冬山茶和茶梅的生物量分配影響的雙因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA of the effects of nitrogen deposition rate and addition frequency on biomass distribution of Camellia japonica(NaiDong) and Camellia sasanqua

圖3 氮沉降量和氮沉降添加頻率的改變對植株生物量分配的影響Fig. 3 Effects of nitrogen deposition rate and nitrogen deposition frequency on biomass distribution of plant

2.4 耐冬山茶和茶梅的氣體交換參數(shù)對不同氮沉降的響應(yīng)

由表5可知，氮沉降量除了對茶梅幼苗的凈光合速率(Pn)影響不顯著、對蒸騰速率(E)影響顯著外，對茶梅幼苗的細(xì)胞間隙CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和氣孔限制值(LS)及耐冬山茶幼苗的氣體交換參數(shù)的影響極其顯著；氮沉降量和添加頻率互作對茶梅Ci和LS有顯著影響，對山茶影響不顯著；添加頻率對兩種植物的氣體交換參數(shù)均無顯著影響(表5)。由圖4可知，在同一添加頻率下，耐冬山茶Pn隨著氮沉降的增加先上升后下降。高添加頻率和中添加頻率下，隨著氮沉降的增加，Ci先下降后上升，低添加頻率處理下Ci呈下降趨勢，相較于對照組和輕度氮沉降量處理組分別下降了51.65%和22.62%。E在高添加頻率和低添加頻率時，隨著氮沉降的增加而呈下降趨勢，中添加頻率處理下，隨著氮沉降的增加先上升后下降；在同一添加頻率下，對照組和輕度氮沉降組基本相似，但重度氮沉降組相較于輕度氮沉降組分別下降了15.72%、18.22%、16.31%。耐冬山茶Gs在相同添加頻率處理下，隨著氮沉降的增加而降低；耐冬山茶LS在高添加頻率和中添加頻率的處理下，隨著氮沉降的增加先上升后下降，低添加頻率處理下隨著氮沉降的增加而上升。茶梅在高添加頻率處理下的Ci隨著氮沉降的增加呈下降趨勢，相較于對照組，輕度氮沉降和重度氮沉降分別下降了44.34%和52.76%，而在中、低添加頻率下隨著氮沉降的增加Ci先下降后上升。高添加頻率下茶梅E和Gs隨著氮沉降的增加呈下降趨勢，中、低添加頻率下降趨勢明顯變緩。在高添加頻率的處理下，隨著氮沉降的增加，茶梅LS呈上升趨勢，而在中添加頻率和高添加頻率處理下先上升后下降。

圖4 氮沉降量和氮沉降添加頻率的改變對植株氣體交換參數(shù)的影響Fig. 4 Effects of nitrogen deposition rate and nitrogen deposition frequency on gas exchange parameters of plant

表5 氮沉降量和添加頻率對耐冬山茶和茶梅的氣體交換參數(shù)影響的雙因素方差分析Table 5 Two-way ANOVA of the effects of nitrogen deposition rate and addition frequency ongas exchange parameters of Camellia japonica(NaiDong) and Camellia sasanqua

2.5 耐冬山茶和茶梅的葉綠素?zé)晒鈱Σ煌两档捻憫?yīng)

初始熒光F0是光系統(tǒng)Ⅱ(PSII)光化學(xué)反應(yīng)中心處于完全開放時的熒光產(chǎn)量，F(xiàn)0高低反映了PSII反應(yīng)中心的活性和植物體色素含量的多少。PSⅡ反應(yīng)中心的潛在活性(Fv/F0)反映了PSⅡ光化學(xué)效率。根據(jù)表6，耐冬山茶F0和Fv/F0受氮沉降量和添加頻率的交互作用影響分別為顯著和極顯著；氮沉降量僅對茶梅的F0有顯著影響。由圖5知，耐冬山茶F0在輕度氮沉降和高添加頻率的條件下高于其他處理組；Fv/Fm在非脅迫環(huán)境下變化極小，而且不受物種和生長條件影響，試驗中各處理該值接近于0.8～0.84，說明植株葉片為健康葉。輕度氮沉降中、低添加頻率的條件下的耐冬山茶Fv/F0顯著高于同氮沉降量的高添加頻率組，這與上述分析的Fv/F0受添加頻率及二者交互作用的影響顯著一致。茶梅幼苗F0在中添加頻率處理下，重度氮沉降量處理組與對照組和輕度氮沉降處理組相比分別下降25.84%和24.24%。

表6 氮沉降量和添加頻率對耐冬山茶和茶梅的葉綠素?zé)晒庥绊懙碾p因素方差分析Table 6 Two-way ANOVA of the effects of nitrogen deposition rate and addition frequencyon chlorophyll fluorescence of Camellia japonica(NaiDong) and Camellia sasanqua

圖5 氮沉降量和氮沉降添加頻率的改變對植株葉綠素?zé)晒獾挠绊慒ig. 5 Effects of nitrogen deposition rate and nitrogen deposition frequency on chlorophyll fluorescence parameters of plant

3 討論

氮元素作為植物生長發(fā)育過程中必不可少的元素，對植物具有重要意義，影響植物的生長與發(fā)育。氮元素的添加頻率同樣影響植株的生長與分布，添加頻率的不同對植株產(chǎn)生的影響不同。

本研究中氮沉降量和添加頻率的交互作用對耐冬山茶幼苗和茶梅幼苗大部分指標(biāo)的影響并不顯著，測定的大部分參數(shù)僅僅受氮沉降或添加頻率的單因素影響。氮沉降量影響了耐冬山茶幼苗和茶梅幼苗的光合作用，氮沉降和氮沉降添加頻率的交互作用沒有對耐冬山茶幼苗的氣體交換參數(shù)產(chǎn)生顯著影響，對茶梅幼苗的影響集中在Ci和LS，因此可以推斷，不同的添加頻率能夠改變植株對氮沉降的響應(yīng)策略[12]。

在光合作用中氮元素的地位極其重要，在蛋白質(zhì)和葉綠素的合成中不可或缺，因此氮沉降對植物進(jìn)行光合起到了積極的促進(jìn)作用，使有機(jī)物的積累增加[11, 13]。Villar-Salvador等[14]、Fang等[15]的研究結(jié)果顯示，高于正常水平的氮沉降會存在促進(jìn)作用，使有機(jī)物積累；另一種觀點(diǎn)則指出，過量的氮元素會不利于生物量的積累，使生產(chǎn)力下降[9, 16-17]。總體來看，耐冬山茶幼苗的基徑在N0(0 g·m-2·a-1)、N1(6 g·m-2·a-1)水平下顯著高于N2(12 g·m-2·a-1)，而茶梅幼苗的冠面積在N0水平下顯著高于N1、N2水平。因此，當(dāng)?shù)两颠_(dá)到N1水平時，茶梅幼苗的生長受到了限制，當(dāng)?shù)两颠_(dá)到N2水平時，對耐冬山茶幼苗的生長有抑制作用，這說明了氮沉降對耐冬山茶和茶梅的促進(jìn)作用存在閾值，且耐冬山茶的閾值要高于茶梅。這種閾值效應(yīng)可能需要更長時間才能反映到兩物種的生物量中。當(dāng)?shù)两递^低時，植物的生長發(fā)育會受到促進(jìn)作用，一旦氮沉降的速率升高超過閾值，其促進(jìn)作用就會下降，這一結(jié)果與前人對元寶楓(Acertruncatum)的研究相一致[16-17]。耐冬山茶幼苗和茶梅的株高不受氮沉降增加的影響，這與之前的研究結(jié)果相反[6, 9, 16]，這可能與葉的其他性狀的變化相關(guān)，比如葉片的Pn、葉綠素含量等。試驗結(jié)果表明耐冬山茶幼苗和茶梅幼苗的生長指標(biāo)受氮沉降加速的影響不大，與麻櫟(Quercusacutissima)、蒙古櫟(Quercusmongolica)等植物的研究結(jié)果相一致[6, 9]，但卻與生菜(Lactucasativa)等植物的研究結(jié)論相悖[18]，這種差異可能是由于不同植物對氮的需求量、敏感程度不同和生長速度迥異造成的。

添加頻率影響了茶梅幼苗的生物量，但耐冬山茶的生物量卻不受添加頻率的影響。較高的添加頻率能夠顯著地增加植物的生物量[2]，茶梅的試驗結(jié)果也證實了這一觀點(diǎn)。Fransen等人[19]通過對多年生植物絨毛草和甘松茅的研究發(fā)現(xiàn)，添加頻率的改變雖然能使植物在短期時間內(nèi)通過大量根系的增生使植物獲取大量的養(yǎng)分，促進(jìn)植物地上部的生長，但從長期的生長來看這種優(yōu)勢很快會消失。由此可以看出，相較于耐冬山茶，茶梅的生物量對添加頻率的響應(yīng)更為敏感，推測可能是因為耐冬山茶的根系相較于茶梅更為發(fā)達(dá)，在低營養(yǎng)物質(zhì)的環(huán)境中，不需要通過增加根系來吸取更多的養(yǎng)分；而茶梅的根系在短時間內(nèi)通過增生獲取大量養(yǎng)分保證生長，從而使茶梅的根生物量比在短時間內(nèi)急速上升。

在氮沉降初期耐冬山茶和茶梅對短時間的氮沉降比較敏感，并且不同的植物對氮沉降呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)可能是因為不同的植物對于氮的敏感度存在差異。Farquhar和Sharkey[20]認(rèn)為：如果植株表現(xiàn)出Pn下降的同時E和Ci也一起下降，則為氣孔因素的原因；如果是非氣孔因素為主要原因，則Pn會隨著Ci的上升而下降，也就是說因為葉肉細(xì)胞光合活性下降而導(dǎo)致了Pn的下降。本研究中耐冬山茶幼苗的Pn升高時，Ci下降；而耐冬山茶幼苗的Pn降低時，Ci上升，說明了耐冬山茶幼苗的Pn受非氣孔因素限制，主要是由于葉肉細(xì)胞光合活性的下降造成的。氮沉降除了對茶梅植株的Pn影響不顯著之外，對兩物種的其他光合參數(shù)均影響顯著，這一結(jié)果與元寶楓的研究結(jié)果一致[16-17]。整體上耐冬山茶隨著氮沉降的增加，Pn、E先升后降，Ci先降后升，Gs下降，LS上升；而茶梅隨著氮沉降的增加，Ci先降后升，E、Gs下降，Ls先升后降。氮沉降添加頻率發(fā)生改變，對山茶和茶梅的生長與氣體交換并無顯著影響，由此推測：一是耐冬山茶幼苗和茶梅幼苗并不需要很多的氮元素，原有的氮元素含量就已經(jīng)足夠，更高的氮沉降并不會使其做出響應(yīng)；二是氮流失導(dǎo)致氮沉降加速并未形成脅迫；三是耐冬山茶幼苗和茶梅幼苗的生長發(fā)育緩慢，短期處理不會產(chǎn)生影響。葉綠素?zé)晒鈪?shù)是研究植物光合作用的探針，能反映出植物進(jìn)行光合作用過程中的變化[19-21]。如果PSⅡ反應(yīng)中心遭受破壞則F0會表現(xiàn)出增加。在本試驗中，耐冬山茶F0在氮沉降條件下，隨著添加頻率的增加而上升，說明較高的添加頻率條件下PSⅡ反應(yīng)中心遭受影響，但并沒有造成不可逆性失活或破壞。耐冬山茶幼苗葉片的Fv/F0在中、高氮沉降量下隨著添加頻率的降低顯著提高，說明隨著添加頻率的降低，葉片的PSⅡ反應(yīng)中心的潛在活性提高。耐冬山茶及茶梅的Fv/Fm未受添加頻率的影響，數(shù)值均維持在0.8～0.84之間，說明了添加頻率對兩種植物的葉綠素最大量子產(chǎn)量無明顯影響。綜上所述，耐冬山茶和茶梅在受到不同氮沉降脅迫時，會通過改變自身的生長性狀和生理活動等抵御或適應(yīng)逆境，因此耐冬山茶和茶梅對氮沉降具有一定耐受性。氮沉降的促進(jìn)作用可能存在閾值，且耐冬山茶的閾值可能明顯高于茶梅，過高的氮沉降會對耐冬山茶和茶梅產(chǎn)生抑制作用。在當(dāng)前氮沉降日益嚴(yán)重的環(huán)境下，耐冬山茶和茶梅適合作為園林綠化樹種繼續(xù)使用，在氮沉降量較低的地區(qū)可以通過增加氮肥的方式促進(jìn)植株的生長，較高的降雨頻率有助于緩解高氮沉降的消極影響。