王 娟，夏 超

0 引 言

冬凌草在民間處方中用作抗炎、解熱和胃藥[1-2]。藍(lán)萼甲素A (glaucocalysin A，GLA)作為從冬凌草葉中提取的二萜類化合物[3]，研究表明其具有抗菌、抗氧化、抗凝血和DNA保護(hù)活性[4-5]。GLA對(duì)癌細(xì)胞和腫瘤的生長(zhǎng)也有不同程度的抑制作用[6]。由于GLA的疏水結(jié)構(gòu)，水溶性較差[7]，已成為臨床抗腫瘤治療的重要障礙。環(huán)糊精可以改善難溶性藥物的溶解性，同時(shí)環(huán)糊精原料廉價(jià)易得，制備方法簡(jiǎn)單，易于操作，成為了改善藥物溶解度的首選方法[8]。本研究通過(guò)環(huán)糊精制備成包合物來(lái)改善GLA的溶解度，從而發(fā)揮其抗腫瘤活性。

環(huán)糊精(cyclodextrin，CDS)是一類由α-1，4-連接的吡喃葡萄糖單元組成的晶體環(huán)狀低聚糖[8-9]。近年來(lái)，它們作為有益的分子螯合劑廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[9]。β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)由于價(jià)格低廉，在其龐大的家族中使用最頻繁，其空腔大小使其有可能包括大多數(shù)常見(jiàn)的客體化合物[9]。然而，β-CD水溶性差、溶血性強(qiáng)、腎毒性大，阻礙了其實(shí)際應(yīng)用[10-11]。因此，羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)和磺丁基醚β-環(huán)糊精(sulfobutyl ether β-cyclodextrin，SBE-β-CD)等人工修飾的β-CD應(yīng)運(yùn)而生[11]。修飾后的β-CD比未修飾的β-CD水溶性更好，毒性更小[12]。可能的原因如下：①SBE-β-CD中的磺酸基等取代基改變了β-CD表面的性質(zhì)，從而提高了其水溶性。②隨著修飾的β-CD分子量的增加，腎小管的重吸收減少，這會(huì)降低腎毒性。研究證實(shí)，SBE-β-CD在水溶性、毒性和增溶方面表現(xiàn)出比HP-β-CD更好的性能[12]。有研究報(bào)道制備了GLA與HP-β-CD的包合物，結(jié)果顯示包合物后的水溶解度增加了13倍[13]。

本研究通過(guò)超聲波法制備GLA在SBE-β-CD中的包合物，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最高的包合效率。并研究GLA-SBE-β-CD對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，采用MTT法檢測(cè)GLA-SBE-β-CD對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的體外抑制效果，為GLA在抗腫瘤的臨床用藥上提供有價(jià)值的劑型參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器GLA(批號(hào)：20180908)由蘇州大學(xué)藥學(xué)院(中國(guó)江蘇)提供。5-氟尿嘧啶購(gòu)自TCI上海有限公司(中國(guó)上海)。SBE-β-CD(南京巨環(huán)醫(yī)療科技有限公司，平均相對(duì)分子質(zhì)量Mw=2.24 kD，平均取代度為7)，牛血清(上海洛神生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，甲基叔丁基醚(南京巨環(huán)醫(yī)藥科技有限公司)，冬凌草甲素(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2-H-四唑溴化物(Sigma-Aldrich Saint Louis, MO)。甲醇為色譜級(jí)，本實(shí)驗(yàn)中使用的水為超純水。除非另有說(shuō)明，所有其他材料均為分析級(jí)。細(xì)胞：人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2和人宮頸鱗癌細(xì)胞SiHA的細(xì)胞株均來(lái)自上海細(xì)胞所。液相色譜[(HPLC LC-20A，島津(日本)儀器有限公司)]，超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，冷凍干燥機(jī)(上海繼譜電子科技有限公司)，差示掃描儀(DSC，美國(guó)TA儀器有限公司)，粉末X射線衍射(XRD, 北京新源志勤科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司)，掃描電子顯微鏡(S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan)，日立離子濺射機(jī)(E-1030, Hitachi, Japan) 。

1.2 色譜條件用配備LC-20A泵和紫外(PDA)檢測(cè)器的島津高效液相色譜測(cè)定GLA的濃度。色譜柱為Kromasil反相C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。流動(dòng)相為蒸餾水∶甲醇(1∶1；V/V)，流速為1.0 mL/min進(jìn)行等量洗脫。柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)231 nm。

1.3 方法

1.3.1 制備GLA-SBE-β-CD包合物采用超聲法和凍干法制備GLA-SBE-β-CD包合物[14-16]。將一定量的SBE-β-CD的水溶液在超聲機(jī)中的燒瓶中恒溫制備，然后在丙酮中慢慢滴加越來(lái)越多的GLA(GLA與SBE-β-CD的摩爾比在1∶5至1∶1之間)到不同的燒瓶中。所得溶液在超聲下絡(luò)合一段時(shí)間，直到達(dá)到平衡，然后在環(huán)境溫度下放置2 h以冷卻。之后，將冷卻后的溶液在真空干燥器中冷凍干燥，通過(guò)0.45 μm膜過(guò)濾后，冷凍干燥得到固體復(fù)合物。準(zhǔn)確稱取一定量的GLA-SBE-β- CD，溶解于流動(dòng)相中，將所得溶液約20 μL注入HPLC中，分析GLA的濃度。通過(guò)測(cè)定包合效率來(lái)選擇得到的包合復(fù)合物。

1.3.2 GLA-SBE-β-CD制備條件優(yōu)化在確定GLA與SBE-β-CD的摩爾比為1∶3為包合物制備的最佳組成基礎(chǔ)上，考察SBE-β-CD水溶液的溫度、時(shí)間、濃度等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)包合效率的影響。因此，對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行單因素檢驗(yàn)，確定各因素的總體水平。然后采用響應(yīng)面方法(RSM)等統(tǒng)計(jì)方法，通過(guò)對(duì)溫度(A)、SBE-β-CD濃度(B)和包合時(shí)間(C)等操作因素的優(yōu)化，使包合物的產(chǎn)量最大化，設(shè)定結(jié)果見(jiàn)表1。在本研究中根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)進(jìn)行擬合，建立數(shù)學(xué)模型(Box-Benhnken設(shè)計(jì)的三因素三水平的響應(yīng)面模型圖。響應(yīng)曲面圖可以反映各變量與包合效率的關(guān)系：曲面越陡，響應(yīng)變量對(duì)變量變化越敏感。等高線圖的形狀可以清楚地反映兩個(gè)變量之間的交互作用是否顯著：橢圓形等高線表示兩個(gè)因素之間的交互作用顯著，反之，等高線的圓度表示兩個(gè)因素之間的交互作用不顯著)，且生成相應(yīng)的多項(xiàng)式方程，便于計(jì)算GLA-SBE-β-CD的實(shí)際包封率(Υ)，計(jì)算公式如下：

表1 Box-Benhnken檢驗(yàn)的三因素和三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

Υ=β0+β1A+ β2B+ β3C+β4AB+β5AC + β6BC+ β7A2+β8B2+β9C2

其中Υ：響應(yīng)變量即為包封率；β0：表示17個(gè)隨機(jī)實(shí)驗(yàn)的所有定量結(jié)果的算術(shù)平均值的截距；β1-β9：根據(jù)Υ的觀測(cè)實(shí)驗(yàn)值計(jì)算的系數(shù)；A、B和C：表示實(shí)驗(yàn)因子；AB、AC、BC：因子交互作用；A2、B2和C2：代表二次項(xiàng)。

1.3.3 GLA-SBE-β-CD增溶效果的研究將過(guò)量的GLA和GLA-SBE-β-CD分別加入10 mL蒸餾水中，然后放入恒溫振蕩器(25 ℃)中24 h，之后將得到的混合物通過(guò)0.45 μm膜過(guò)濾，并使用HPLC方法分別測(cè)定飽和溶液中的GLA的含量，計(jì)算其溶解度。

1.3.4 DSC分析差示掃描量熱法(DSC)研究GLA-SBE-β-CD包合物(a)及其物理混合物(b)的熱性能，并記錄GLA(c)和SBE-β-CD(d)的DSC曲線，以驗(yàn)證GLA在SBE-β-CDs空腔中的包結(jié)或部分包結(jié)。使用差示熱掃描儀對(duì)GLA、SBE-β-CD、物理混合物以及GLA-SBE-β-CD在氮?dú)獯祾邨l件下進(jìn)行了熱分析。將3～5 mg樣品放在坩堝上，加熱溫度為50～350 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3.5 XRD表征在PW1720型X射線發(fā)生器和PW1710型衍射儀上研究GLA、SBE-β-CD、其物理混合物和GLA-SBE-β-CD的粉末X射線衍射圖譜。工作電壓為40 mA，電流為40 mA，由銅的Kα輻射產(chǎn)生。對(duì)GLA、SBE-β-CD、其物理混合物和GLA-SBE-β-CD粉末進(jìn)行掃描，掃描步長(zhǎng)為0.04°～35°，掃描速度為0.02°/s，用Jade6.0 XRD圖形處理軟件(Materials Data，Inc，Irvine，CA)對(duì)樣品進(jìn)行X射線分析。

1.3.6 SEM表征用掃描電子顯微鏡對(duì)GLA、SBE-β-CD和GLA-SBE-β-CD的表面形貌進(jìn)行研究。在日立離子濺射機(jī)上，用雙膠帶將粉末樣品粘在試樣臺(tái)面上，涂上導(dǎo)電鉑膜，觀察樣品并記錄照片。

1.3.7 人源癌細(xì)胞的抑制研究選用臨床診斷中最為常見(jiàn)且致死率較高的4種人癌細(xì)胞，初步研究GLA-SBE-β-CD包合物和GLA對(duì)人源癌細(xì)胞的抑制效果。以含10%胎牛血清的RPMI-1640為培養(yǎng)基，采用梯度稀釋法制備不同濃度的GLA和GLA-SBE-β-CD(1、10、100 μg/mL)。將4種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的癌細(xì)胞懸液接種到96孔板中(細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)/孔)，分別加入不同濃度的GLA或GLA-SBE-β-CD。空白組不給予培養(yǎng)液。對(duì)照組只給予不含藥的培養(yǎng)液。在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，用10 μL MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化銨)和90 μL新鮮培養(yǎng)基取代RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，在搖床中絡(luò)合10 min，直至甲醛結(jié)晶完全溶解。用StatFAx-2100酶聯(lián)免疫吸附儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)二甲基亞砜-細(xì)胞混合液的吸光度，平行檢測(cè)一式三份，取平均值計(jì)算癌細(xì)胞抑制率(IR)：

IR=[1-(ODdrug-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)]100%

其中ODdrug表示藥物組的光密度，ODblank表示空白組的光密度，ODControl表示對(duì)照組的光密度。

2 結(jié) 果

2.1 GLA-SBE-β-CD包合物的制備隨著SBE-β-CD的加入，包合效率提高，當(dāng)GLA與SBE-β-CD的比例達(dá)到1∶3時(shí)，包合效率超過(guò)80%。當(dāng)比例從1∶3繼續(xù)增加時(shí)，包合效率未見(jiàn)明顯提高?？紤]到輔料、原料藥的浪費(fèi)和加工難度的增加，確定GLA與SBE的比例為1∶3為包合物的最佳比例。見(jiàn)表2。

表2 不同摩爾比下藍(lán)萼甲素A在磺丁基醚β-環(huán)糊精中的包合率

2.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)法優(yōu)化GLA-SBE-β-CD制備條件實(shí)際擬合方程式為：

Υ=-173.65+9.42A+2.34B+0.974C+9.89×10-3AB-2.687×10-3AC-3.67×10-3BC-0.139A2-0.0685B2-0.011C2

BBD矩陣及響應(yīng)值見(jiàn)表3。三維響應(yīng)面和等高線圖見(jiàn)圖1。響應(yīng)面二次模型的方差分析(ANOVA)顯示見(jiàn)表4。結(jié)果表明，該模型具有較高的F值(33.34)和極低的P值(<0.0001)，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！皵M合不足”的P值為0.0666(>0.05)，表明實(shí)際結(jié)果與擬合模型無(wú)顯著性差異。R2和調(diào)整后的R2分別為0.9772和0.9479，表明實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)變量之間有很好的相關(guān)性。溫度(A)、SBE-β-CD濃度(B)、包合時(shí)間(C)的F值分別為1.57、5.86、0.91，表明包合效率受SBE-β-CD濃度(B)的影響最大，受包合時(shí)間(C)的影響最小。變異系數(shù)(CV)為3.47%(<15%)，結(jié)果均在正常標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。由響應(yīng)曲面圖可見(jiàn)，SBE-β-CD(B)的濃度對(duì)包合效率的影響最大。由等高線圖可見(jiàn)，AB和AC之間的交互作用是顯著的，而B(niǎo)C之間的交互作用不顯著。

圖1 Box-Benhnken設(shè)計(jì)的三因素三水平的響應(yīng)面模型圖

表3 Box-Benhnken設(shè)計(jì)的三因素三水平矩陣擬合結(jié)果和響應(yīng)值(R)

根據(jù)STATEASE公司的Design Expert軟件(MN 55413，美國(guó))的計(jì)算結(jié)果，可以得到最佳的實(shí)驗(yàn)參數(shù)和理論上的最大包合效率。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，確定SBE-β-CD濃度為18.5%，包合溫度為35 ℃，包合時(shí)間為42 min。在最佳工藝條件下進(jìn)行制備，平均產(chǎn)率為87.28%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.02%。這一包合率略低于理論值(87.40%)，但在誤差范圍內(nèi)。

2.3 GLA-SBE-β-CD增溶效果的研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GLA的在水介質(zhì)中的溶解度為0.213 mg/mL，而GLA-SBE-β-CD的溶解度為17.96 mg/mL，已經(jīng)達(dá)到GLA的84.3倍，說(shuō)明GLA-SBE-β-CD包合物的成功制備大大提高了GLA在水介質(zhì)中的溶解度。

2.4 DSC分析GLA曲線在225 ℃處有一個(gè)尖銳的吸熱峰，與其熔點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。SBE-β-CD在300 ℃出現(xiàn)一個(gè)不規(guī)則的峰，是降解過(guò)程的結(jié)果。與純GLA和SBE-β-CD相比，物理混合物中GLA在225 ℃的吸熱峰減弱，SBE-β-CD的吸熱峰增強(qiáng)。GLA-SBE-β-CD的熱圖顯示，純GLA的原始吸熱峰消失，表明GLA完全包合在SBE-β-CD中。見(jiàn)圖2。

a:GLA-SBE-β-CD包合物; b: GLA-SBE-β-CD物理混合物; c:SBE-β-CD; d: GLA

2.5 XRD表征GLA圖譜顯示多個(gè)清晰的峰，表明GLA以典型的晶線形式存在。相反，SBE-β-CD表現(xiàn)為一條平坦的曲線，在掃描范圍內(nèi)只有一次微弱的上升，表明其為非晶態(tài)。在其物理混合物的衍射圖中觀察到了GLA的主要特征峰，但強(qiáng)度較低。從GLA-SBE-β-CD圖譜可以看出，GLA的大部分特征結(jié)晶峰已經(jīng)消失。這一現(xiàn)象表明，GLA不再以晶態(tài)存在，而是包含在SBE-β-CD空腔中。見(jiàn)圖3。

圖3 不同制備方法下的混合物和藍(lán)萼甲素A的的X-衍射圖

2.6 SEM分析SBE-β-CD為邊界光滑的球形，而GLA為尖角狀和光滑的柱狀晶體。在它們的物理混合物照片中，明顯觀察到SBE-β-CD的球形和GLA的柱狀晶體。在GLA-SBE-β-CD的照片中，SBE-β-CD和GLA的特殊形態(tài)特征已不存在。GLA-SBE-β-CD顆粒呈無(wú)定形，略大于GLA和SBE-β-CD。GLA-SBE-β-CD的表面形貌明顯不同于物理混合物、GLA和SBE-β-CD，已形成了一種新的物相。見(jiàn)圖4。

a:GLA原料藥;b:SBE-β-CD;c:GLA原料藥和SBE-β-CD物理混合物;d:GLA-SBE-β-CD包合物圖4 不同制備方法下的混合物和藍(lán)萼甲素A的的掃描電鏡圖

2.7 人源癌細(xì)胞抑制作用研究不同濃度的GLA和GLA-SBE-β-CD對(duì)A549、Hela、HepG2、SiHA細(xì)胞的抑制率見(jiàn)圖5。GLA及其包合物對(duì)這4種腫瘤細(xì)胞均有明顯的抑制作用，GLA-SBE-β-CD對(duì)這4種腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯高于GLA。濃度為10 μg/mL GLA-SBE-β-CD組對(duì)A549和HepG2的抑制率為(84.18±4.26)%和(76.29±1.29)%，略低于對(duì)Hela(88.02±2.90)%和SiHA(90.38±4.1)%的抑制率，也說(shuō)明了GLA在抑制癌細(xì)胞上具有一定的選擇性，且具有濃度依賴性。

a：A549;b：Hela；c：HepG2；d：SiHA圖5 藍(lán)萼甲素A及磺丁醚-β-環(huán)糊精包合物對(duì)A549、Hela、HepG2、SiHA細(xì)胞抑制作用

3 討 論

本研究采用超聲波法制備了GLA-SBE-β-CD包合物，在制備過(guò)程中考察了GLA和SBE-β-CD的比例對(duì)包封率的影響，同時(shí)通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)法優(yōu)化了制備中溫度、SBE-β-CD濃度和包合時(shí)間等條件對(duì)包封率的影響，篩選出包封率最高時(shí)的制備條件，確定了最佳制備工藝，然后又通過(guò)XRD、SEM和DSC對(duì)GLA-SBE-β-CD包合物進(jìn)行表征，結(jié)果表明GLA與SBE-β-CD形成包合物。最后選取4種常見(jiàn)的致死率較高的癌細(xì)胞，初步考察GLA-SBE-β-CD包合物對(duì)其增值的抑制效果。實(shí)驗(yàn)表明GLA-SBE-β-CD包合物的制備改善了GLA的水溶性，且GLA-SBE-β-CD包合物的包封率達(dá)到87%。GLA-SBE-β-CD包合物的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)效果明顯高于未被包合的GLA，表明該方法制備的GLA-SBE-β-CD包合物能夠有效提高GLA的溶解度，加速了癌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)本研究選用的4種癌細(xì)胞均屬于臨床診斷中較為常見(jiàn)的癌細(xì)胞，所制備的GLA-SBE-β-CD包合物為以后GLA活性成分的臨床用藥提供了一定理論依據(jù)。

綜上所述，本研究通過(guò)使用包合物的制劑手段使GLA活性成分在臨床抗腫瘤中具備一定的應(yīng)用潛力和開(kāi)發(fā)價(jià)值，此外還有待深一步對(duì)其體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，為臨床用藥提供劑量參考。