魏秀蓮，劉 瀅，劉雪連*，婁迎霞 ，張 樂(lè)，尹靖東

（1.北京市飼料監(jiān)察所，北京 100107；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

飼料中禁用促生長(zhǎng)類抗生素給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了前所未有的挑戰(zhàn)，益生菌作為一類安全、綠色的促生長(zhǎng)類抗生素替代品具有廣闊的應(yīng)用前景。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，羅伊氏乳桿菌作為益生菌制劑添加于動(dòng)物飼料中具有抑制胃腸道病原菌繁殖、改善動(dòng)物免疫力、減少動(dòng)物發(fā)病率、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、降低耗料增重比等有益效果[1-6]。育雛期是蛋雞生產(chǎn)周期中至關(guān)重要的時(shí)期，雛雞的生長(zhǎng)發(fā)育直接影響其后續(xù)生產(chǎn)性能的發(fā)揮。雛雞具有生長(zhǎng)迅速、代謝旺盛、消化系統(tǒng)發(fā)育不健全、消化能力弱和抵抗力差等生理特點(diǎn)，改善蛋雛雞體質(zhì)對(duì)于蛋雞生產(chǎn)具有重要意義[7]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已把羅伊氏乳桿菌列入了《飼料添加劑品種目錄》。在羅伊氏乳桿菌產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中，通常會(huì)將發(fā)酵液進(jìn)行離心，留下菌體制成凍干粉，上清液做排污處理，造成資源浪費(fèi)和環(huán)保壓力。羅伊氏乳桿菌在蛋雛雞上的應(yīng)用研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)旨在研究添加不同羅伊氏乳桿菌發(fā)酵物對(duì)蛋雛雞生長(zhǎng)性能、器官指數(shù)及腸道形態(tài)的影響，以期為羅伊氏乳桿菌在蛋雛雞生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 主要試劑：羅伊氏乳桿菌DBNJP 分離自健康仔豬糞便，保藏于大北農(nóng)集團(tuán)飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；羅伊氏乳桿菌凍干粉：由羅伊氏乳桿菌DBN-JP 菌泥凍干制成（含羅伊氏乳桿菌活菌5.0×1010CFU/kg）；羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液：由羅伊氏乳桿菌DBN-JP 菌在MRS 培養(yǎng)基中37℃，發(fā)酵48 h 制成（含羅伊氏乳桿菌活菌5.0×1010CFU/L）；羅伊氏乳桿菌上清液：由羅伊氏乳桿菌DBN-JP 菌在MRS 培養(yǎng)基中37℃，發(fā)酵48 h 后，10 000 r/min 離心10 min 后，所得上清液經(jīng)121℃，滅菌15 min 制成；上述制劑均由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)用海蘭褐蛋雛雞由唐山玉田大北農(nóng)提供。試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼糧由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司提供。

主要儀器：酶標(biāo)儀（Epoch，Thermo）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（QuantStudio，賽默飛）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)地點(diǎn)在北京海華恒盛養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)雞舍及配備的蛋雛雞養(yǎng)殖設(shè)備均由該養(yǎng)殖場(chǎng)提供。試驗(yàn)選取體重（36.17±0.14）g 的1 日齡海蘭褐蛋雛雞1 200 只，隨機(jī)分為4 組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50 只。其中，凍干粉組為：基礎(chǔ)飼料+羅伊氏乳桿菌凍干粉1 kg/t；發(fā)酵液組為：基礎(chǔ)飼料+羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液1 L/t；上清液組為：基礎(chǔ)飼料+羅伊氏乳桿菌上清液1 L/t；對(duì)照組：僅飼喂基礎(chǔ)飼料；采用3 層籠養(yǎng)的方式，預(yù)試期3 d，正試期39 d?；A(chǔ)飼糧參照NRC（1994），并結(jié)合《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 332004）配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。試驗(yàn)期間自由采食，飲水充足，日常雞舍管理方案和相關(guān)免疫程序依照雞場(chǎng)育雛場(chǎng)規(guī)范實(shí)行。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能 試驗(yàn)期間每天準(zhǔn)確記錄死淘只數(shù)和腹瀉只數(shù)；于蛋雛雞日齡8、15、22、29、36、43 日齡08:00 空腹稱重。稱重前一天20:00 斷料，飲水自由，以各重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)體重、耗料量、脛長(zhǎng)，計(jì)算體重均勻度、平均日采食量、脛長(zhǎng)均勻度、死淘率。

體重均勻度=[平均體重×（1±10%）的樣本數(shù)量/總抽測(cè)樣本數(shù)量]×100%

平均日采食量=試驗(yàn)期總采食量/試驗(yàn)期

平均日增重=（末重-初重）/天數(shù)

耗料增重比=平均日采食量/平均日增重

脛長(zhǎng)均勻度=[ 平均脛長(zhǎng)×（1±5%）的樣本數(shù)量/總抽測(cè)樣本數(shù)量]×100%

死淘率=死亡只數(shù)/總只數(shù)×100%

1.3.2 器官指數(shù) 于蛋雛雞43 日齡，每個(gè)重復(fù)挑選4 只接近平均體重的蛋雛雞進(jìn)行屠宰，屠宰前一天20:00 斷料，飲水自由。屠宰后，完整摘取試驗(yàn)雞的內(nèi)臟器官稱重，計(jì)算蛋雛雞器官指數(shù)。

器官指數(shù)=器官鮮重/活體重×100%

1.3.3 腸道形態(tài) 于蛋雛雞43 日齡，每個(gè)重復(fù)挑選10只接近平均體重的蛋雛雞進(jìn)行屠宰，屠宰前一天20:00斷料，飲水自由。分離十二指腸、空腸和回腸，分別取中段1.5～2 cm；用生理鹽水沖洗干凈后置于10%福爾馬林溶液中固定、密封，在4℃冰箱放置24 h，制作石蠟切片，H.E.染色，用光學(xué)顯微鏡及圖像處理系統(tǒng)測(cè)定腸道絨毛高度和隱窩深度，計(jì)算絨毛高度和隱窩深度比值（絨隱比）。

1.3.4 盲腸內(nèi)容物菌群 將含有大腸桿菌、乳酸桿菌和沙門(mén)氏菌目的片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別建立各菌群的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用實(shí)時(shí)熒光定量方法對(duì)所有樣本拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同微生物的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用IBM SPASS Statistics 24 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），運(yùn)用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，以P＜0.05 判斷差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞生長(zhǎng)性能的影響 由表2 可知，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液可以降低1～7 日齡以及29～35 日齡的蛋雛雞死淘率，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉和發(fā)酵液可顯著降低36～42 日齡蛋雛雞的死淘率；飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液可顯著提高15～21、29～35、1～42 日齡蛋雛雞的平均日增重；飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液可顯著降低1～42 日齡蛋雛雞的耗料增重比。

表2 羅伊氏乳桿菌對(duì)1～42 日齡蛋雛雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞器官指數(shù)的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液可顯著提高腺胃指數(shù)；飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉可顯著提高盲腸指數(shù)，其他器官指數(shù)無(wú)顯著變化。

表3 羅伊氏乳桿菌對(duì)1～42 日齡蛋雛雞器官指數(shù)的影響 %

2.3 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞腸道形態(tài)的影響 由表4 可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液對(duì)十二指腸、空腸絨毛高度和絨隱比沒(méi)有顯著影響。

表4 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞小腸形態(tài)的影響

2.4 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞盲腸內(nèi)容物菌群的影響 由表5 可知，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、上清液、發(fā)酵液盲腸內(nèi)容物中的大腸桿菌數(shù)量顯著降低；添加羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液和上清液，盲腸內(nèi)容物中的沙門(mén)氏菌數(shù)量顯著降低，添加羅伊氏乳桿菌凍干粉對(duì)沙門(mén)氏菌數(shù)量影響不顯著；飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液，盲腸內(nèi)容物中乳桿菌數(shù)量顯著提高，添加上清液對(duì)盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量影響不顯著。

表5 羅伊氏乳桿菌對(duì)蛋雛雞盲腸內(nèi)容物菌群的影響 Lg（CFU/g）

3 討 論

3.1 羅伊氏乳桿菌對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能的影響 羅伊氏乳桿菌是一種專性異型發(fā)酵菌株，對(duì)動(dòng)物胃腸道酸堿環(huán)境具有較好的適應(yīng)能力。羅伊氏乳桿菌具有多種生物學(xué)功能，尤其在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)和促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮重要作用[8-9]。羅伊氏乳桿菌可產(chǎn)生多種酶、氨基酸和維生素等對(duì)動(dòng)物有益的物質(zhì)，能夠促進(jìn)畜禽對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉可顯著提高15～21、29～35 日齡蛋雛雞的平均日增重，且可顯著提高1～42 日齡的平均日增重，降低料重比，降低蛋雛雞1～7、29～42 日齡的死淘率，這與邵洪偉等[12]、何穎等[13]、王晶等[14]、李文立等[15]、袁華根[16]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明在飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉具有提高蛋雛雞生長(zhǎng)性能的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，與凍干粉組相比，發(fā)酵液組和上清液組對(duì)相同時(shí)期蛋雛雞的平均日增重、料重比、死淘率的影響差異不顯著，這說(shuō)明在蛋雛雞飼糧中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、上清液、發(fā)酵液均具有提高蛋雛雞平均日增重，降低耗料增重比和死淘率的作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，常將羅伊氏乳桿菌發(fā)酵上清液作為廢棄物排污，根據(jù)本研究結(jié)果，可探討是否可將羅伊氏乳桿菌發(fā)酵上清液作為提高蛋雛雞生長(zhǎng)性能的產(chǎn)品進(jìn)行開(kāi)發(fā)，合理利用資源，避免資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。

體重均勻度和脛長(zhǎng)均勻度是蛋雞育雛期的重要指標(biāo)，根據(jù)海蘭褐商品蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，42 日齡體重均勻度、脛長(zhǎng)均勻度達(dá)標(biāo)率對(duì)后期蛋雞的產(chǎn)蛋性能有重要影響[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液對(duì)1～42 日齡蛋雛雞的體重均勻度和脛長(zhǎng)影響不顯著。

3.2 羅伊氏乳桿菌對(duì)雛雞器官指數(shù)的影響 蛋雛雞1～42日齡是內(nèi)臟器官發(fā)育的重要時(shí)期[18]，本研究結(jié)果表明，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉可以顯著提高蛋雛雞腺胃指數(shù)和盲腸指數(shù)，對(duì)其他器官指數(shù)如法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)等影響不明顯；本研究結(jié)果還表明，僅凍干粉組顯示盲腸指數(shù)顯著提高，添加發(fā)酵液組的盲腸指數(shù)凍干粉組和對(duì)照組相比變化不顯著，添加上清液組與對(duì)照組相比變化不顯著。盲腸是微生物的主要活動(dòng)場(chǎng)所，凍干粉組和發(fā)酵液組中更高的活菌數(shù)可能對(duì)盲腸指數(shù)提高起到重要作用；而凍干粉組比發(fā)酵液組盲腸器官指數(shù)更高，可能與凍干粉組的凍干保護(hù)劑對(duì)菌體具有保護(hù)作用，到達(dá)盲腸的活菌數(shù)更高而引起的；但因乳酸菌對(duì)器官指數(shù)影響的報(bào)道不多，具體原因還需更進(jìn)一步探討。

3.3 羅伊氏乳桿菌對(duì)雛雞腸道形態(tài)的影響 益生菌可通過(guò)促進(jìn)腸道發(fā)育，維護(hù)腸黏膜形態(tài)健康來(lái)提高蛋雛雞的生長(zhǎng)性能[19]，小腸是家禽消化、吸收食物營(yíng)養(yǎng)的主要場(chǎng)所，腸道結(jié)構(gòu)的完整性關(guān)系到動(dòng)物生長(zhǎng)速度，小腸的腸絨毛高度、隱窩深度及其比值是衡量腸道發(fā)育的重要指標(biāo)[20-22]。Yihb 等[23]、Olsonjk 等[24]研究表明，給新生仔豬灌服羅伊氏乳桿菌具有促進(jìn)腸絨毛發(fā)育的作用。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在1～42 日齡蛋雛雞飼糧中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、發(fā)酵液、上清液對(duì)十二指腸、空腸絨毛高度、隱窩深度和絨隱比均沒(méi)有顯著影響，這可能與動(dòng)物品種和菌株差異性有關(guān)。

3.4 羅伊氏乳桿菌對(duì)盲腸內(nèi)容物菌群的影響 益生菌進(jìn)入消化道后，具有維持腸道菌群平衡，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的有益效果[25]。乳酸桿菌作為畜禽腸道主要的有益菌群，具有改善腸道功能，提高飼料消化率和生物效價(jià)作用，同時(shí)可以抑制腸道致病菌生長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫力[26-27]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉具有降低盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌、沙門(mén)氏菌數(shù)量，提高乳桿菌數(shù)量的有益效果，這與張亞蘭等[28]、張雷等[29]的研究結(jié)果類似，說(shuō)明飼料中添加羅伊氏乳桿菌可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)改善家禽的生產(chǎn)性能。本研究還發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液和上清液也具有降低雛雞盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的作用，且與凍干粉組差異不顯著，這說(shuō)明在抑制病原菌方面，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液、上清液具有類似效果。但相比于對(duì)照組，凍干粉組對(duì)盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量的影響更顯著，發(fā)酵液組次之，上清液乳酸桿菌數(shù)量也有上升趨勢(shì)，但差異不顯著，這可能與凍干粉和發(fā)酵液中羅伊氏乳桿菌活菌數(shù)更高有關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果證明，在飼糧中添加羅伊氏乳桿菌凍干粉、上清液或發(fā)酵液具有提高蛋雛雞生產(chǎn)性能、降低死淘率、促進(jìn)雛雞腺胃、盲腸器官發(fā)育、調(diào)節(jié)盲腸內(nèi)容物腸道菌群的有益效果，綜合比較，凍干粉組效果最好。