火龍珠種子無菌萌發(fā)研究

李曉亮 楊世先 楊進(jìn)成 王剛 張鐘 陳佳清 周翠英 左麗娟 鄧成忠 張玉榮 段永華

摘要 [目的]建立火龍珠種子的無菌苗技術(shù)體系，為火龍珠的種苗快繁、種質(zhì)保存、遺傳轉(zhuǎn)化及雜交實(shí)生苗獲得等提供可行的技術(shù)途徑。[方法]選擇和采集4種不同大小的火龍珠果實(shí)進(jìn)行滅菌、無菌播種和種子培養(yǎng)試驗(yàn)，調(diào)查記錄種子的萌發(fā)情況。[結(jié)果]火龍珠果實(shí)的適宜滅菌方法是0.20% HgCl2滅菌8～16 min;火龍珠不同種子的無菌萌發(fā)差異明顯，相比其他3類果實(shí)的種子，最大橫徑為（11.19±0.21） mm、單果重（0.66±0.02） g的果實(shí)內(nèi)種子發(fā)芽起始時間較早（30 d后），發(fā)芽持續(xù)時間較長（60 d），萌發(fā)頻率較高（100%），發(fā)芽率較大（7.81±0.50）%，種子萌發(fā)形成的幼苗株高、葉片數(shù)、節(jié)間距、節(jié)段數(shù)、增殖系數(shù)等較大，幼苗生長勢較強(qiáng)，是火龍珠無菌苗獲得的適宜果實(shí)。[結(jié)論]通過選擇合適的火龍珠果實(shí)進(jìn)行種子無菌播種，可以建立火龍珠高效的無菌苗技術(shù)體系，且是一個重要的途徑。

關(guān)鍵詞 火龍珠;果實(shí);種子;組織培養(yǎng);無菌萌發(fā)

中圖分類號 S 686? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）23-0140-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.038

Study on Seed Aseptic Germination of Hypericum

LI Xiao-liang， YANG Shi-xian， YANG Jin-cheng et al

（Yuxi Academy of Agricultural Sciences， Yuxi， Yunnan 653100）

Abstract [Objective]To establish the aseptic seedling technical system of Hypericum by its seeds， in turn to provide one feasible technical approach for rapid propagation of seedling， germplasm conservation， genetic transformation， and hybrid seedling， etc.[Method] 4 different types fruits of Hypericum were selected and gathered to carry out experiments of sterilization， aseptic seed sowing and seed culture.[Result] The results showed that a suitable approach for fruits of Hypericum was to treat 8-16 min by 0.20% HgCl2， and there was a great difference in different seeds aseptic germination of Hypericum. Compared with seeds in the other 3 kinds of fruits， fruits containing maximum diameter of （11.19±0.21）mm and single fruit weight of （0.66±0.02） g were suitable fruits for obtaining aseptic seedling of Hypericum， because its seed had earlier （30 d after aseptic seed sowing） and last for 60 d of seed germination， higher germination frequency of 100%， higher germination rate of （7.81±0.50）%， higher indexes of seedlings height， leaf number， knot spacing， sections and proliferation coefficients， and stronger seedling growth vigour.[Conclusion] It is the seed aseptic germination of these suitable Hypericum fruits that establish? an efficient aseptic seedling technical system of Hypericum， which is an important approach.

Key words Hypericum;Fruit;Seed;Tissue culture;Aseptic germination

基金項(xiàng)目 玉溪市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研項(xiàng)目“作物組培擴(kuò)繁及配套栽培技術(shù)研究與應(yīng)用”（YXNKYZP2020）。

作者簡介 李曉亮（1982—），男，云南江川人，高級農(nóng)藝師，碩士，從事植物（作物）組織培養(yǎng)技術(shù)研究與應(yīng)用、果蔬作物的育種及栽培等。通信作者，高級農(nóng)藝師，從事果蔬作物育種及栽培研究。

收稿日期 2021-07-19

種子是種子植物特有的器官，繁殖是其主要功能，這對于延續(xù)物種起著至關(guān)重要的作用。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)（簡稱“組培”）進(jìn)行種子的培養(yǎng)，可以快速繁殖種苗，打破種子休眠以促進(jìn)其萌發(fā)，解決作物雜交胚胎敗育及繁育作物雜交的后代等具有重要意義[1]。國內(nèi)以種子開展植物組織培養(yǎng)研究的報道較多，如石斛[2]、白芨[3]、云南甜龍竹[4]、牛角瓜[5]、黃精[6]、灰?guī)r金線蓮[7]等作物的組培快繁種苗技術(shù)研究;月季的休眠種子無菌萌發(fā)研究[8];月季的胚挽救技術(shù)研究[9];金花茶雜交種子的組培研究[10]等?；瘕堉椋℉ypericum），屬金絲桃科歐金絲桃屬，低矮灌木，單葉，對生或輪生，有腺點(diǎn)，多全緣，花瓣為5瓣，以黃色為主，雄蕊多數(shù)，通常合生，火龍珠常用作切果或觀花，葉厚紙質(zhì)，果形高圓、無青肩、成熟后大紅亮麗，富光澤，經(jīng)久貯存果色不變，嬌艷可愛，深受人們的喜愛，是一種重要的觀賞性花卉植物[11]。近年來，火龍珠的生產(chǎn)發(fā)展迅速，因其種植投資成本低（不需大棚設(shè)施等）、產(chǎn)量高、價格好、見效快等優(yōu)點(diǎn)，形成火龍珠較好的種植經(jīng)濟(jì)效益，在云南省滇中地區(qū)的江川區(qū)、通?？h等地廣泛引進(jìn)種植，且種植規(guī)模不斷擴(kuò)大[12]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，目前有關(guān)火龍珠組織培養(yǎng)鮮見研究報道。無菌苗獲得是植物組織培養(yǎng)中一個起始性和關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)，對植物組織培養(yǎng)全過程起著至關(guān)重要的作用，亟待開展相關(guān)研究。為此，開展火龍珠不同種子無菌萌發(fā)的試驗(yàn)研究，擬解決3個關(guān)鍵問題：①火龍珠種子能否在常規(guī)培養(yǎng)條件下無菌萌發(fā);②不同時期火龍珠種子無菌萌發(fā)情況;③能否通過火龍珠種子無菌萌發(fā)建立高效的無菌苗技術(shù)體系。通過研究，旨在建立火龍珠種子的高效無菌苗技術(shù)體系，為火龍珠的種苗快繁、種質(zhì)保存、遺傳轉(zhuǎn)化及雜交實(shí)生苗獲得等提供可行的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

以粉果火龍珠果實(shí)內(nèi)含有的種子為研究對象，火龍珠果實(shí)采集于云南省玉溪市江川區(qū)火龍珠種植田塊。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)采集。

按照果實(shí)的最大橫徑（mm）、單果重（g）2個指標(biāo)將火龍珠果實(shí)劃分成A、B、C、D 4種類型（圖1）。隨機(jī)采集生長正常、無病蟲害發(fā)生的4類果實(shí)，各類分別采集6個，密封后帶回室內(nèi)處理。

1.2.2 果實(shí)滅菌。

摘除果實(shí)的葉子和葉柄，先用流水沖洗果實(shí)0.5 min，再用洗潔精水浸泡2.5 min后流水沖洗干凈，最后于超凈工作臺上用75%乙醇浸泡消毒30 s后進(jìn)行果實(shí)滅菌。

對4種類型的果實(shí)均設(shè)計5個滅菌試驗(yàn)處理：處理①（0.20% HgCl2滅菌8 min），處理②（0.20% HgCl2滅菌10 min），處理③（0.20% HgCl2滅菌12 min），處理④（0.20% HgCl2滅菌14 min），處理⑤（0.20% HgCl2滅菌16 min）。

1.2.3 無菌播種。

在超凈工作臺上，將滅菌后的果實(shí)縱切成兩半，隨機(jī)挑取果實(shí)內(nèi)部的種子接入MS培養(yǎng)基中。

1.2.4 種子培養(yǎng)。

種子完成無菌播種后，將種子置于溫度（25±2） ℃，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，光照時間12 h/d的培養(yǎng)室中培養(yǎng)120 d。期間，觀察記錄種子的顏色變化、萌發(fā)、苗生長等數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計按以下公式計算：細(xì)菌污染率=細(xì)菌污染的瓶數(shù)/總瓶數(shù)×100%;發(fā)芽率=發(fā)芽的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%;萌發(fā)頻率=有種子萌發(fā)的瓶數(shù)/總瓶數(shù)×100%;增殖系數(shù)=新生的莖段（芽）數(shù)/母株的莖段（芽）數(shù)×100%。

采用Excel 2003和SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)滅菌

不同滅菌處理對火龍珠4種類型果實(shí)的滅菌效果差異不明顯，各滅菌處理的細(xì)菌污染率均為0，成活率均為100%，滅菌效果較好，說明0.20% HgCl2滅菌8～16 min，適宜用于火龍珠的果實(shí)滅菌。

2.2 種子的無菌萌發(fā)情況

火龍珠不同類型種子無菌萌發(fā)的差異明顯（表1、圖2）。A、B類果實(shí)種子萌發(fā)頻率和發(fā)芽率為0;D類果實(shí)的種子萌發(fā)頻率最大，為100%，C類果實(shí)的種子萌發(fā)頻率僅為28.57%;D類果實(shí)的種子發(fā)芽率、萌發(fā)形成的幼苗株高、葉片數(shù)、節(jié)間距、節(jié)段數(shù)、增殖系數(shù)均顯著大于C類果實(shí)（P<0.05）;D、C類果實(shí)種子萌發(fā)形成的幼苗生長勢較強(qiáng)，D類在母株幼苗上有明顯的增殖分化現(xiàn)象發(fā)生，而C類沒有增殖分化現(xiàn)象發(fā)生（圖2）。

2.3 種子萌發(fā)的時間動態(tài)規(guī)律

火龍珠不同種子進(jìn)行無菌播種后，種子萌發(fā)的時間動態(tài)規(guī)律差異明顯（圖3）。A、B類果實(shí)的種子在120 d內(nèi)無萌發(fā)現(xiàn)象發(fā)生;C類果實(shí)的種子在第60天后開始萌發(fā)，持續(xù)時間為30 d，發(fā)芽率為1.49%;D類果實(shí)的種子在第30天后開始萌發(fā)，持續(xù)時間60 d，第2個30 d期間的發(fā)芽率為3.24%，第3個30 d期間的發(fā)芽率為4.57%。D類果實(shí)比C類果實(shí)的種子發(fā)芽起始時間較早，持續(xù)時間較長，發(fā)芽率較高。由此可知，火龍珠種子的萌發(fā)時間為無菌播種后的60～90 d。

3 結(jié)論與討論

外植體滅菌是植物組織培養(yǎng)中重要步驟，其是指用化學(xué)藥物破壞微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或使酶類失活，阻止正常代謝而殺死微生物，化學(xué)藥劑選擇和使用方法對外植體的滅菌效果有直接影響[12]。該研究結(jié)合多年的組培經(jīng)驗(yàn)，用0.20% HgCl2滅菌火龍珠果實(shí)，不同處理間的滅菌效果差異不明顯，但有較好的滅菌效果，細(xì)菌污染率為0，成活率為100%，這可能是由于火龍珠果實(shí)類型屬于蒴果，果實(shí)內(nèi)部的種子處于“無菌”態(tài)，只要將果實(shí)外部的微生物殺死，且有果實(shí)外部的“保護(hù)”作用，外部殺傷一定程度上對種子活性影響不大，就會得到理想的滅菌效果。由此說明，蒴果的滅菌時間彈性幅度較大，滅菌較易于操作，這為今后該類外植體的滅菌提供了重要參考，同時也說明對火龍珠果實(shí)進(jìn)行滅菌比較容易，是獲得火龍珠無菌外植體的理想途徑。

該研究中，不同大小的火龍珠果實(shí)代表果實(shí)的不同發(fā)育時期，A、B、C、D 4類果實(shí)分別為幼果、近中年果、中年果、近成熟果。根據(jù)植物組培技術(shù)的原理[1，13]，理論上A、B、C、D 4類果實(shí)的種子都能萌發(fā)。但該研究顯示，不同火龍珠種子無菌萌發(fā)的差異明顯，A、B類果實(shí)的種子通過無菌播種得不到無菌苗，C、D類果實(shí)的種子通過無菌播種能很好地獲得健壯的幼苗。這種差異可能是與培養(yǎng)基的成分有關(guān)。一般來說，大多數(shù)作物種子萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基是MS，其常用于種子的無菌播種。該研究使用MS培養(yǎng)基對不同的火龍珠種子進(jìn)行培養(yǎng)，由于A、B類種子未成熟，可能是MS培養(yǎng)基不能促進(jìn)其萌發(fā)，還需加入其他成分（如植物生長調(diào)節(jié)劑等），這需進(jìn)行進(jìn)一步研究。C、D類果實(shí)的種子在MS培養(yǎng)基上能萌發(fā)出健壯的幼苗，說明火龍珠通過種子無菌萌發(fā)建立無菌苗技術(shù)體系較容易，且可行。

該研究中，火龍珠D類果實(shí)的種子無菌播種到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)后出現(xiàn)了明顯的增殖現(xiàn)象，這區(qū)別于以往的認(rèn)識：一般來說，在植物組織培養(yǎng)中，須在MS培養(yǎng)基中加入植物生長調(diào)節(jié)劑（如6-BA、NAA等）后才會有增殖現(xiàn)象發(fā)生[1，13]，這可能是由于火龍珠生長分化能力較強(qiáng);另一方面，在火龍珠A、B、C、D類果實(shí)中，D類果實(shí)的種子發(fā)芽起始時間較早，持續(xù)時間較長，相比其他作物的種子無菌發(fā)芽率（84.4%～93.0%）[14-15]，其種子發(fā)芽率較低，僅為7.81%，但其有100%的萌發(fā)頻率，一個D類果實(shí)中含有很多非常細(xì)小的種子，可以播出同D類瓶一樣的20～30個無菌瓶（約75粒種子/瓶），每個無菌瓶內(nèi)的種子萌發(fā)形成的幼苗健壯、節(jié)段較多，且幼苗有增殖系數(shù)為3.67的增殖發(fā)生，因此，按這樣計算，獲得無菌苗是比較高效的。由此可見，該研究通過試驗(yàn)篩選出了適宜的火龍珠果實(shí)進(jìn)行無菌播種，從而成功建立了火龍珠種子的高效無菌苗技術(shù)體系。通過該體系，不斷增殖無菌苗的莖段或頂芽后完成生根培養(yǎng)就會產(chǎn)生大量的種苗，其成為火龍珠種苗組織培養(yǎng)快繁的重要途徑，從而促進(jìn)火龍珠的生產(chǎn)發(fā)展。

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