油松枯梢病菌孢子萌發(fā)率測定方法探索

史丹陽，任曉婧，魏步飛，許子怡，孫玉琴，李會平，4

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071001；2.黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025；3.木蘭縣太平種子林林場，黑龍江 木蘭 151900;4.河北省城市森林健康技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001)

油松Pinustabuliformis為中國特有松科針葉常綠喬木，具有很強(qiáng)的抗寒抗旱能力，在我國多省均有分布，是我國北方地區(qū)非常重要的造林和綠化景觀樹種[1]。油松對山地植被恢復(fù)也起著十分重要的作用，具有生態(tài)服務(wù)功能[2]。

2004年首次在秦皇島市聯(lián)峰山發(fā)現(xiàn)油松枯梢病，病原菌為松球殼孢菌Sphaeropsissapinea[3]。該病原菌的分生孢子器為黑色球形，半埋生于松梢表皮層，分生孢子長橢圓形，單胞或多胞，淺棕色，著生在分生孢子器內(nèi)[4]。在研究該病菌的越冬場所、侵入途徑、侵染過程，篩選化學(xué)防治和生物防治藥劑的過程中，孢子萌發(fā)試驗是一項非常重要的工作[5-6]。傳統(tǒng)方法是在獲得分生孢子器的基礎(chǔ)上，配制孢子懸浮液，采用懸滴法、水瓊脂表面萌發(fā)法、培養(yǎng)皿萌發(fā)法、瓊脂平板表面萌發(fā)法等測定孢子萌發(fā)率，這是一項非常繁瑣且復(fù)雜的工作[7]。而且，該病菌不易在人工培養(yǎng)基中產(chǎn)生分生孢子器，因此獲得純凈足量的分生孢子也是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。前期研究發(fā)現(xiàn)可以在滅菌松針上快速誘導(dǎo)出大量分生孢子器[8]，這些分生孢子器在適宜條件下即開始萌發(fā)產(chǎn)生菌絲。因此筆者探索以分生孢子器萌發(fā)率代替孢子萌發(fā)率的可能及兩者之間的關(guān)系，以期為油松枯梢病分生孢子萌發(fā)率的測定提供一種快速、便捷的方法。

1 材料與方法

1.1試驗材料 油松枯梢病菌Sphaeropsissapinea分離自秦皇島聯(lián)峰山的油松枯梢病株病梢，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理實驗室提供。分生孢子器誘導(dǎo)用松針，采自秦皇島聯(lián)峰山公園生長健壯的2 a生油松。

1.2試驗方法

1.2.1分生孢子器誘導(dǎo)和孢子懸浮液制備 將松針用自來水沖洗后，自然風(fēng)干，切成約1 cm的小段，置于培養(yǎng)皿中，加少量蒸餾水以保持其濕潤，121 ℃高壓滅菌25 min，連續(xù)高壓滅菌3次，供試菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上生長3 d后，接種滅菌松針；在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待松針的分生孢子器和分生孢子成熟后取出，放置在無菌培養(yǎng)皿中備用。

用接種針將松針上的分生孢子器輕輕挑下，無菌水浸泡10 min后取出，使分生孢子完全釋放于無菌水中，配成濃度為1×106個/mL孢子懸浮液。

1.2.2懸滴法測定分生孢子萌發(fā)率 將孢子懸浮液滴于蓋玻片上，翻轉(zhuǎn)平放于凹玻片凹槽上，置于大培養(yǎng)皿中，用棉球蘸無菌水保濕。25 ℃恒溫光照培養(yǎng)2～50 h，每隔2 h觀察1次孢子萌發(fā)率。每次觀察5個載玻片作為重復(fù)，每個載玻片觀察5個視野，每次觀察500～800個孢子。芽管長度超過孢子直徑長度(指直徑最小的一邊)的一半，視為已經(jīng)萌發(fā)。

分生孢子萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100

1.2.3分生孢子器萌發(fā)率測定 將至少有80個分生孢子器的油松松針用無菌水沖洗后，0.1%的升汞表面消毒30 s，滅菌水沖洗3次，置于鋪有3層滅菌濕濾紙的培養(yǎng)皿中，LRH-250-G光照培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)2～50 h，每隔2 h光學(xué)顯微鏡下觀察其萌發(fā)情況，每次觀察5個油松松針。有菌絲自分生孢子器周圍伸出，長度超過分生孢子器直徑的一半，視為已經(jīng)萌發(fā)。

分生孢子器萌發(fā)率(%)=產(chǎn)生菌絲的分生孢子器/分生孢子器總數(shù)×100

1.3數(shù)據(jù)分析 利用一元線性回歸分析，用SPSS軟件對分生孢子器萌發(fā)率和孢子萌發(fā)率進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1分生孢子器誘導(dǎo)結(jié)果 滅菌油松松針接種于PDA培養(yǎng)基上15 d后開始出現(xiàn)黑色的突起，即分生孢子器(圖1)。分生孢子器直徑為0.5～1.4 mm，黑色球形，半埋生在松針表皮層，后突出外露。

圖1 油松枯梢病菌分生孢子器Fig.1 Pycnidia of S.sapinea

2.2分生孢子萌發(fā)過程 懸滴法測定的分生孢子萌發(fā)過程如圖2所示。分生孢子在處理2 h后開始萌發(fā)，長出芽管；隨著時間的延長，芽管的長度逐漸增加。孢子萌發(fā)率隨著時間的增長逐漸升高，2 h時孢子萌發(fā)率為22.3%，10 h時為34.4%，20 h時為55.3%，40 h時為78.2%，50 h時孢子萌發(fā)率趨于穩(wěn)定，達(dá)84.3%(表1)。

A.未萌發(fā)Not germination；B.萌發(fā)2 h Germinated for 2 hours；C.萌發(fā)6 h Germinated for 6 hours；D.萌發(fā)8 h Germinated for 8 hours

2.3分生孢子器萌發(fā)過程 生有分生孢子器的松針保濕培養(yǎng)后，逐漸在分生孢子器的周圍觀察到菌絲體(圖3)。

處理后2 h，分生孢子器開始萌發(fā)，周圍可觀察到少量菌絲，萌發(fā)率為3.9%，隨著時間的延長，菌絲逐漸增多、長度增加，萌發(fā)率逐漸增高，20 h時為39.0%，40 h為64.1%，到50 h時萌發(fā)率趨于穩(wěn)定，達(dá)80.0%(表1)。

表1 不同時間的分生孢子和分生孢子器萌發(fā)率Tab.1 Germination rate of conidia and pycnidia at different time

A.未萌發(fā)Not germination；B.萌發(fā)2 h Germinated for 2 hours；C.萌發(fā)6 h Germinated for 6 hours；D.萌發(fā)10 h Germinated for 10 hours

2.4分生孢子萌發(fā)率與分生孢子器萌發(fā)率的關(guān)系 分生孢子器萌發(fā)率和孢子萌發(fā)率之間具有線性關(guān)系，可用一元回歸方程y=0.195+0.864x表示，其中y為孢子萌發(fā)率，0.195為回歸截距，0.864為回歸系數(shù)(即傾向趨勢)，x為分生孢子器萌發(fā)率，分生孢子的萌發(fā)率和分生孢子器萌發(fā)率之間的線性關(guān)系較好(圖4)。

方差分析表明，分生孢子器萌發(fā)率與孢子萌發(fā)率之間具有線性關(guān)系(df=23，F(xiàn)=1 113.559，P=0<0.05)。

圖4 分生孢子萌發(fā)率與分生孢子器萌發(fā)率之間的一元線性回歸Fig.4 One variable linear regression of the relationship between conidia germination rate and pycnidia germination rate

利用回歸方程y=0.195+0.864x，對分生孢子的萌發(fā)率進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測值和實際值見表2。

可以看出利用該方程對分生孢子萌發(fā)率進(jìn)行預(yù)測時，預(yù)測值和實際值誤差較小，可以用于實際孢子萌發(fā)率測定研究中(表2)。

表2 分生孢子萌發(fā)率預(yù)測值和實際值比較Tab.2 Comparison between predicted and actual values of conidia germination rate

3 結(jié)論與討論

本研究中采用了分生孢子器萌發(fā)法和一元線性回歸分析，通過用SPSS軟件對油松枯梢病分生孢子器萌發(fā)率和孢子萌發(fā)率進(jìn)行線性回歸分析。分生孢子器萌發(fā)率和孢子萌發(fā)率之間具有線性關(guān)系，兩者的比值圍繞一定值波動，可以近似地用一元回歸方程表示。利用該回歸方程測算油松枯梢病分生孢子萌發(fā)率，方法簡便，可以作為孢子萌發(fā)率測定的代用方法。對于其他可以產(chǎn)生子實體的病原真菌孢子萌發(fā)率的測定，也可以借鑒此方法，但由于不同真菌的萌發(fā)要求和萌發(fā)過程不同，其回歸方程需要單獨摸索。