胭脂紅番石榴葉黃酮提取物的抑菌活性及其機理

闞玉紅，謝筆鈞，孫智達

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

番石榴(PsidiumguajavaL.)，又名雞矢果、拔子，屬桃金娘科(Myrtaceae)、番石榴屬(Psidium)，是多年生的常綠灌木植物。番石榴葉為番石榴的干燥葉及帶葉嫩枝，具有抗菌、降血糖、收斂止瀉、消炎止血等功效[1-3]。黃酮類化合物是番石榴葉中的重要生物活性成分，具有良好的抗氧化、抗菌、抗癌等藥理活性[4-6]。

食品防腐劑是指為提高食物的品質(zhì)或者延緩由微生物、酶解和氧化引起的食品降解，而添加到食物中的天然物質(zhì)或化學(xué)合成物質(zhì)[7-8]。食品領(lǐng)域中常采用的化學(xué)防腐劑，如山梨酸鹽、亞硝酸鹽和苯甲酸鹽等，其中有的對人體健康有一定的不良影響[9]。隨著人們生活水平的提高，消費者們越來越關(guān)注食品安全問題，尤其是微生物導(dǎo)致的食物腐敗和化學(xué)添加劑帶來的毒害作用。因此，尋找天然、綠色和安全的防腐劑已成為研究者們關(guān)注的熱門課題。有研究表明，將天然防腐劑添加在食品中，可延長食品的保藏時間[10-12]。

本研究使用胭脂紅番石榴葉為原料，提取其中的黃酮類化合物并鑒定其成分；通過測定抑菌率、MIC和MBC、生長殺滅曲線評價番石榴葉黃酮對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用；通過細(xì)胞壁通透性實驗、流式細(xì)胞儀分析、蛋白質(zhì)滲漏、胞內(nèi)ROS水平分析和掃描電鏡(SEM)觀察探究其抑菌機制。該研究對進一步開發(fā)和綜合利用番石榴葉提供了有價值的研究，同時也為打開番石榴葉黃酮提取物作為天然防腐劑市場提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胭脂紅番石榴葉：購自福建漳州；無水乙醇、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等(均為國產(chǎn)分析純)：購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)：美國Fisher公司；金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸桿菌ATCC51659：從中國普通微生物菌種保藏管理中心購得。

VCX750超聲破碎儀 美國索尼克斯公司；UV-2100型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；Thermo Scientific Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Thermo Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher科技有限公司；WE-1水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；CW-CJ-1D單人凈化工作臺 蘇州凈化儀器設(shè)備有限公司；激光FACSVerse分析型流式細(xì)胞儀 美國BD公司；HTX多功能酶標(biāo)儀 美國寶特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮的提取和純化

1.2.1.1 超聲輔助提取總黃酮

稱取80 g胭脂紅番石榴葉粉末，按料液比1∶10(g/mL)加入75%的乙醇溶液，設(shè)定超聲功率為150 W，超聲波占空比為6，超聲時間為35 min。提取完成后在7000×g下離心10 min，收集上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)40 ℃減壓去除乙醇并濃縮，得到番石榴葉黃酮粗提液50 mL。

1.2.1.2 總黃酮的純化

將上述黃酮粗提液負(fù)載于AB-8大孔樹脂上，采用20倍量蒸餾水進行洗脫，以除去水溶性雜質(zhì)，隨后用70%的乙醇進行洗脫，收集洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi) 40 ℃減壓除去乙醇,再進行冷凍干燥[13]，得到番石榴葉黃酮提取物4.83 g(以下簡稱RGLF)。

1.2.2 總黃酮得率和純度的測定

采用硝酸鋁比色法測定總黃酮含量，根據(jù)李培源等[14]的方法稍作修改。配制0.5 mg/mL的黃酮溶液，吸取0.3 mL黃酮溶液于10 mL比色管中，加入5% NaNO2溶液0.2 mL，混勻后于室溫放置6 min，再加入10% Al(NO3)3溶液0.2 mL，混勻后于室溫放置6 min，隨后加入5% NaOH溶液1 mL，用乙醇溶液定容至5.0 mL，混勻放置15 min，采用紫外可見分光光度計于510 nm處測定吸光值。

配制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法顯色后測定吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定黃酮濃度，并計算純度。得率和純度計算公式如下：

1.2.3 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物組成的鑒定

以甲醇為溶劑，將凍干的番石榴葉黃酮提取物粉末配制成0.5 mg/mL的樣品溶液，使用 0.22 μm 濾膜過濾后進行組分分析。色譜柱：ZORABX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序見表1，流速為1 mL/min，進樣體積為10.0 μL[15]。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 The mobile phase gradient elution procedure

質(zhì)譜條件：離子源為ESI，在負(fù)離子模式下，噴霧電壓為3200 V，毛細(xì)管溫度為300 ℃，鞘氣(氮氣)為40 L/h，輔助氣體(氮氣)流速15 L/h，氣化溫度為350 ℃，S-Lens射頻水平為50%，離子掃描范圍在50～1500 m/z。

1.2.4 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物的抑菌活性評價

1.2.4.1 抑菌率的測定

抑菌實驗采用96孔板微量肉湯培養(yǎng)基二倍稀釋法[16]。將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種活化好后，根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱ù_定稀釋倍數(shù)，調(diào)節(jié)菌液濃度為108CFU/mL。配制濃度為2.5 mg/mL的樣品溶液，使用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為106CFU/mL。以青霉素作為陽性對照，將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，于全波長讀數(shù)儀上測定其吸光值(OD600 nm)。

式中：As為不同濃度樣品吸光值；A0為空白對照吸光值。

1.2.4.2 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

根據(jù)美國臨床和標(biāo)準(zhǔn)實驗室協(xié)會制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行實驗[17]。以青霉素作為陽性對照，將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者，即為受試菌的 MIC。根據(jù)MIC 結(jié)果，在上述培養(yǎng)24 h后的96孔板中每孔取100 μL于MH固體培養(yǎng)基中，用滅菌接種環(huán)輕推藥液，將平皿置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長，以培養(yǎng)皿中計數(shù)少于5個菌落作為受試菌的MBC。

1.2.4.3 生長殺滅曲線的繪制

采用時間殺滅曲線研究抗菌藥物濃度對96孔板中細(xì)菌生長的影響。根據(jù)1.2.4.1中的方法配制樣品溶液，調(diào)節(jié)菌液濃度并在96孔板中加樣培養(yǎng)。將96孔板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔2 h測定一次吸光值(OD600 nm)。

1.2.5 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物的抑菌機制研究

1.2.5.1 對細(xì)胞壁通透性的影響

參照周先漢和李橋妹的方法并作部分修改[18-19]。調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液濃度為108CFU/mL，向菌液中加入黃酮樣品，使樣品終濃度為2 MIC，并在37 ℃恒溫水浴搖床中振蕩培養(yǎng)。分別在30，60，90，120，150 min時取樣，于510 nm處測定吸光值，平行測定3次，取平均值，同時在相同條件下以不加黃酮樣品作為對照。

1.2.5.2 PI染色實驗

用流式細(xì)胞儀測定經(jīng)碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色的細(xì)菌的染色率來評估樣品溶液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的膜通透性的損傷效應(yīng)[20]。調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液濃度為5×108CFU/mL，向菌液中加入樣品液，使其終濃度為0.5 MIC并在37 ℃水浴搖床中培養(yǎng)。在40 min時取樣，用無菌生理鹽水清洗菌體2次，隨后加入1 mL濃度為10 μg/mL的PI染料，于4 ℃避光染色30 min。離心棄去上清液，使用無菌生理鹽水清洗菌體以除去殘余染料。清洗完全的菌體使用生理鹽水重懸，迅速于流式細(xì)胞儀上測定PI染色率。

1.2.5.3 蛋白質(zhì)滲漏實驗

使用考馬斯亮藍法測定經(jīng)樣品處理過的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中的蛋白質(zhì)滲漏量[21]。按1.2.5.2中的方法進行加樣處理，在 37 ℃水浴搖床中培養(yǎng)，分別在 2，4，6，8，10，12 h時離心取上清液測吸光值。使用牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白質(zhì)滲漏量。

1.2.5.4 胞內(nèi)ROS分析

根據(jù)Ning等[22]測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的方法作部分修改。調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液濃度為5×109CFU/mL，按1.2.5.2中的方法進行加樣處理，在 37 ℃水浴搖床中培養(yǎng)，在不同時間段取樣，用生理鹽水洗滌2次，將1 mL 10 μg/mL DCFH-DA溶液添加到細(xì)菌細(xì)胞中，于37 ℃避光染色30 min,用生理鹽水清洗菌體，除去殘余染料。隨后用生理鹽水重懸菌體并加入到96孔板中，通過多功能酶標(biāo)儀測量細(xì)胞內(nèi) ROS 的相對熒光強度(RFI)(Ex 485 nm/Em 528 nm)。

1.2.5.5 RGLF對細(xì)菌菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液濃度為5×108CFU/mL，按1.2.5.2中的方法進行加樣處理，使其終濃度為0.5 MIC并在37 ℃水浴搖床中培養(yǎng)10 h。用生理鹽水清洗2次后迅速加入2.5%戊二醛固定液，在4 ℃條件下固定4 h。用生理鹽水清洗菌體3次，將菌體依次置于30%、50%、70%乙醇水溶液中進行梯度脫水。將脫水完成的菌體進行冷凍干燥處理。取適量菌體粘于AI臺的導(dǎo)電膠上，鍍金后放入掃描電鏡腔室內(nèi)進行觀察[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以O(shè)rigin 8.6和 Excel 2016進行處理,采用SPSS 26.0進行顯著性分析(p<0.05),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物純度和得率測定

將黃酮粗提液經(jīng)大孔樹脂純化，結(jié)果表明：AB-8大孔樹脂對番石榴葉黃酮提取物有較強的純化富集作用，70%乙醇洗脫能得到純度較高的產(chǎn)物,最終超聲輔助提取法得到番石榴葉黃酮的純度為85.58%，得率為6.04%。

2.2 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物的四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜分析

使用Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，以ESI作為離子源在負(fù)離子模式下對番石榴葉黃酮提取物化學(xué)組成進行分析。將所得質(zhì)譜特征與文獻報道值進行比較，同時化合物所測得的分子量的實驗值與理論值的相對誤差均小于5×10-6，從而確定了樣品中化合物的組成，結(jié)果見表2。

表2 四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜分析番石榴葉中的組分Table 2 The analysis of components in the leaves of Psidium guajava L. by quadrupole-orbital well high resolution mass spectrometry

續(xù) 表

這些化合物中有12種(1，2，4～13號)先前已由Díaz-de-Cerio等從番石榴葉中鑒定出[24]，3號化合物先前已由Elixabet Díaz-de-Cerio等通過HPLC-DAD-QTOF-MS從番石榴葉中鑒定出[25]，在本文中通過高分辨質(zhì)譜分析得到了驗證。

化合物4的分子離子峰[M-H]-為289.0720，保留時間在4.46 min，對應(yīng)的二級碎片為245.0815 [M-CO2]-，203.0709[M-2C2H2O-2H]-，179.0342[M-C6H6O2]-，125.0233(C環(huán)1，4鍵斷裂)m/z ，與文獻進行比對并依據(jù)分子量相對誤差值(0.48×10-6)，鑒定該化合物為兒茶素[26]，分子式是C15H14O6。

化合物13的分子離子峰[M-H]-為301.0357，保留時間在27.40 min，對應(yīng)的二級碎片為178.9979，151.0028 m/z，其質(zhì)譜特征與槲皮素的一級、二級碎片完全一致，且分子量相對誤差值為0.99×10-6，可確定該物質(zhì)是槲皮素[27]，分子式為C15H10O7。

化合物9，10，11的分子離子峰[M-H]-分別為433.0780，433.0781和433.0782，保留時間分別在18.30，19.08，20.66 min，并分別產(chǎn)生m/z為301.0342，301.0329和301.0345的槲皮素碎片片段，這些碎片離子對應(yīng)于槲皮素-戊糖苷中戊糖苷部分的缺失(即433～132 Da)，由此可知，這3個化合物均為槲皮素-戊糖苷，根據(jù)文獻中所報道的出峰順序及分子量相對誤差(分別為0.92×10-6，1.13×10-6，1.20×10-6)，推測這3種化合物為槲皮素-戊糖苷的異構(gòu)體，分別是瑞諾苷、番石榴苷和扁蓄苷，分子式是C20H18O11。

化合物6的分子離子峰[M-H]-為449.0730，保留時間在13.08 min，對應(yīng)的二級碎片為316.0226(為碎片離子m/z 317.0276-H)，317.0276(為準(zhǔn)分子離子[M-H]-丟失戊糖基)m/z，即449.0703～132 Da。碎片離子271.0251[M-H-C6O6H10]-m/z即449.0703～178 Da，根據(jù)Chang Chi-Huang 等前期鑒定的結(jié)果及分子量相對誤差值(0.99×10-6)，推測該化合物為楊梅素-阿拉伯糖苷/吡喃木糖苷異構(gòu)體[28]，分子式是C20H18O12。

化合物8的分子離子峰[M-H]-為463.0888，保留時間在16.79 min，對應(yīng)的二級碎片為301.0345，300.0276，178.9979，151.0027 m/z。其中301.0345 m/z對應(yīng)于槲皮素-己糖苷中己糖苷部分(162 Da)的缺失，300.0276 m/z為碎片離子脫去一個氫(即301.0345-H)，碎片離子178.9979，151.0027 m/z為槲皮素的特征碎片離子。因此，確定該化合物為槲皮素-己糖苷，根據(jù)文獻中所報道的出峰順序及分子量相對誤差值(1.44×10-6)，推測該物質(zhì)是異槲皮苷，分子式是C21H20O12。

化合物7的分子離子峰[M-H]-為477.0678，保留時間在16.60 min，對應(yīng)的二級碎片301.0355，151.0027 m/z為該化合物的特征碎片，其中碎片301.0355 m/z為該化合物丟失葡萄糖醛酸基，即[M-C6O6H9]-，碎片151.0027 m/z為槲皮素的特征碎片，上述結(jié)果與文獻[24]和文獻[28]報道的一致，且分子量相對誤差為0.79×10-6，故鑒定該物質(zhì)為槲皮素-葡萄糖醛酸苷，分子式是C21H18O13。

化合物5的分子離子峰[M-H]-為479.0835，保留時間在12.42 min，對應(yīng)的二級碎片為317.0274([M-H-162]-)，316.0224，271.0249 m/z，除317.0274 m/z中性損失162己糖部分，形成楊梅素糖苷配基，其余的碎片離子與化合物6相同，且其分子量相對誤差為0.73×10-6，因此推測該化合物是楊梅素-己糖苷異構(gòu)體[29]，分子式是C21H20O13。

化合物2的分子離子峰[M-H]-為577.1357，保留時間在3.30 min，對應(yīng)的二級碎片為425.0887，407.0777，289.0720，125.0233 m/z，其中289 m/z對應(yīng)于兒茶素或(表)兒茶素，407 m/z表明兩個亞基之間存在4β-6連接，且其分子量相對誤差為1.13×10-6，因此將該化合物鑒定為兒茶素或(表)兒茶素-兒茶素或(表)兒茶素連接的B型原花青素二聚體，分子式是C30H26O12。

化合物12的分子離子峰[M-H]-為585.0894，保留時間在22.84 min，對應(yīng)的二級碎片為433.0779，301.0346，283.0474，169.0134 m/z ，碎片301.0346 m/z為該化合物的準(zhǔn)分子離子(M-H)失去一個戊糖基和沒食子?；拈纹に剀赵乃槠x子峰[(M-H)-132-152]-，283.0474 m/z為槲皮素苷元脫去一個中性水分子所形成的碎片離子峰[(M-H)-132-152-H2O]-，根據(jù)參考文獻及分子量相對誤差(-0.89×10-6)，推測該物質(zhì)是Guavinoside C(quercetin 3-O-(5″-O-galloyl)-alpha-L-arabinofuranoside，即槲皮素3-O-(5″-O-沒食子?；?-α-L-阿拉伯呋喃糖苷)[30-31]，分子式是C27H22O15。

化合物1的分子離子峰[M-H]-為593.1309，保留時間在2.93 min，對應(yīng)的二級碎片分別為425.9880，289.0723 m/z ，對應(yīng)于(表)兒茶素與(表)沒食子兒茶素或沒食子兒茶素連接的二聚體，其分子量相對誤差為-1.46×10-6，與文獻進行比對，推測該物質(zhì)是原飛燕草素二聚體異構(gòu)體，分子式是C30H26O13。

化合物3的分子離子峰[M-H]-為745.1417，保留時間在3.36 min，對應(yīng)的二級碎片為 593.1312，575.1203，423.0724，305.0669 m/z，根據(jù)Jaiswal等提出的MS/MS碎片模式及分子量相對誤差(0.92×10-6)，推測該化合物為沒食子酰基(表)兒茶素-(表)沒食子兒茶素連接的二聚體[32]，分子式是C37H30O17。

由以上結(jié)果可知，番石榴葉黃酮提取物中除了含有槲皮素及其糖苷外，還含有原花青素和楊梅素糖苷等物質(zhì)。

2.3 胭脂紅番石榴葉黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用

2.3.1 抑菌率的測定

RGLF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制率見圖1。

圖1 RGLF對金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003(A)、大腸桿菌ATCC51659(B)的抑制率Fig.1 The inhibition rates of RGLF on S. aureus CMCC(B)26003 (A)and E. coli ATCC51659 (B)

由圖1可知，RGLF對金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003和大腸桿菌EscherichiacoliATCC51659均有抑制作用。對于金黃色葡萄球菌，在實驗濃度范圍內(nèi)RGLF對其的抑制率均為100%；而對于大腸桿菌，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，抑制率也隨之增大，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系(p<0.05)，當(dāng)樣品濃度為1.25 mg/mL時，RGLF對大腸桿菌ATCC51659的抑制率可達到90%以上，且IC50為0.103 mg/mL，青霉素在實驗濃度范圍內(nèi)對兩種菌的抑制率均為100%；以上結(jié)果表明RGLF對金黃色葡萄球菌的抑制能力比大腸桿菌強，這與Farhana Jasmin Ara 等[33]的研究結(jié)果一致。

2.3.2 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

RGLF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC和MBC值見表3。

表3 RGLF對金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸桿菌ATCC51659的MIC和MBC值Table 3 The minimum inhibition concentration (MIC)and minimum bactericidal concentration (MBC)values of RGLF on S. aureus CMCC(B)26003 and E. coli ATCC51659

將RGLF對兩種細(xì)菌的MIC和MBC值進行比較，可以發(fā)現(xiàn)RGLF作用于兩種細(xì)菌后對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC值最低，表明RGLF對金黃色葡萄球菌的抑制能力要強于大腸桿菌，這與抑菌率所得出的結(jié)果一致。

2.3.3 對生長曲線的影響

RGLF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長曲線的影響見圖2。

由圖2可知，RGLF對其生長周期均有一定的影響，表現(xiàn)為延滯期變長，而對數(shù)期變短或消失。隨著樣品濃度的增大，RGLF對兩種菌的抑制能力也越來越強。當(dāng)樣品濃度為0.156 mg/mL時可以完全抑制金黃色葡萄球菌的生長；當(dāng)樣品濃度為1.25 mg/mL時可以阻止大腸桿菌進入對數(shù)生長期，完全抑制其生長。因此，RGLF對金黃色葡萄球菌的抑制作用優(yōu)于大腸桿菌。

圖2 RGLF對金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003(a)、大腸桿菌ATCC51659(b)生長曲線的影響Fig.2 The effect of RGLF on the growth curves of S. aureusCMCC(B)26003(a)and E. coli ATCC51659(b)

2.4 胭脂紅番石榴葉黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌機制分析

2.4.1 對細(xì)胞壁通透性的影響

堿性磷酸酶位于細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的間隙之中，正常情況下不會向外分泌，但當(dāng)細(xì)胞遭到破壞后，其會泄露到細(xì)胞外，因此可以通過檢測細(xì)胞外酶的變化反映細(xì)胞壁通透性的變化[34-35]。RGLF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌細(xì)胞壁通透性的影響見圖3。

圖3 金黃色葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)堿性磷酸酶含量的變化Fig.3 The changes of alkaline phosphatase content ofStaphylococcus aureus (a)and Escherichia coli (b)

由圖3可知，隨著時間的延長，空白對照組的堿性磷酸酶含量無明顯變化，而加了黃酮樣品的菌懸液胞外堿性磷酸酶含量先增加后變平穩(wěn)。處理時間在30，150 min時，金黃色葡萄球菌實驗組在510 nm處的吸光值分別為0.143和0.221；大腸桿菌在510 nm處的吸光值分別為0.563和0.681，二者OD值的變化可能是因為RGLF與細(xì)菌已作用完全，故后期堿性磷酸酶含量無明顯變化。

2.4.2 PI染色實驗

經(jīng)RGLF處理后兩種菌體 PI 熒光染色鏡檢結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在初始濃度、培養(yǎng)時間均相同的情況下，對照組的PI染色率較低(金黃色葡萄球菌為4.93%，大腸桿菌為4.77%)，有極少部分細(xì)菌被染色，一方面是因為菌體自身凋亡引起；另一方面是因為一部分活性較弱的菌體在環(huán)境條件變化的情況下主動激活某些基因的表達和調(diào)控，導(dǎo)致菌體死亡[36]。經(jīng)RGLF處理后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的PI染色率明顯增加，表明有較多的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)胞膜遭到破壞，從而使PI染料能夠進入到細(xì)菌內(nèi)部。金黃色葡萄球菌的PI染色率為90.6%，大腸桿菌的PI染色率為25.8%，說明RGLF對金黃色葡萄球菌有較高的抑制活性，這與上面得到的研究結(jié)果一致。

圖4 RGLF處理金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的PI染色分析Fig.4 PI staining analysis of Staphylococcus aureus and Escherichia coli treated with RGLF注：橫坐標(biāo)表示通道的熒光信號值，縱坐標(biāo)表示熒光信號值對應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。

2.4.3 蛋白質(zhì)滲漏實驗

經(jīng)RGLF處理后金黃色葡萄球菌和大腸桿菌胞外蛋白質(zhì)滲漏量的變化見圖5。蛋白質(zhì)是維持細(xì)菌菌體生命活動的基礎(chǔ)物質(zhì)，當(dāng)菌體細(xì)胞膜被破壞時，蛋白質(zhì)就會滲漏到細(xì)胞外，因此可以通過測定胞外蛋白質(zhì)含量來反映RGLF對細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞作用。

圖5 RGLF對金黃色葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)蛋白滲漏量的影響Fig.5 The effect of RGLF on the protein penetration amount of Staphylococcus aureus(a)and Escherichia coli(b)

由圖5可知，經(jīng)RGLF處理2 h后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的蛋白滲漏量分別為20.43，322.10 μg/mL，當(dāng)處理時間為12 h時，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的蛋白滲漏量分別達到35.10，345.27 μg/mL，表明隨著時間的延長，胞外蛋白質(zhì)滲漏得越多，細(xì)菌細(xì)胞膜被大量破壞，致使細(xì)胞膜的穿透性變大，大分子蛋白質(zhì)能泄露到細(xì)胞外，且金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)含量增長速率較快，經(jīng)樣品處理6 h后，大腸桿菌的蛋白質(zhì)滲漏量趨于平緩。

2.4.4 胞內(nèi)ROS分析

經(jīng)RGLF處理后金黃色葡萄球菌和大腸桿菌胞內(nèi)ROS的變化見圖6。熒光染料DCFH-DA用于分析和定量ROS的產(chǎn)生，用于研究細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化及氧化應(yīng)激水平。

圖6 RGLF對金黃色葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)胞內(nèi)ROS強度的影響Fig.6 The effect of RGLF on the intracellular ROS intensity of Staphylococcus aureus (a)and Escherichia coli (b)

由圖6可知，在同一樣品濃度下，經(jīng)RGLF培養(yǎng)后，細(xì)菌細(xì)胞中以時間依賴的方式檢測到熒光強度的增加。與空白對照組相比，樣品組在細(xì)胞中產(chǎn)生了大量的ROS，當(dāng)處理時間為0.5 h時，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌胞內(nèi)ROS強度較弱，分別為22.67和88.00；當(dāng)處理時間為2.5 h時，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌胞內(nèi)ROS強度分別高達54.67和148.67。隨著時間的延長，在金黃色葡萄球菌細(xì)胞中ROS強度的增加幅度比大腸桿菌大，說明RGLF對金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響比大腸桿菌大，胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著增加，從而達到了抑菌的作用。

2.4.5 SEM分析

通過電子掃描電鏡觀察了RGLF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，見圖7。

圖7 RGLF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 The effect of RGLF on the morphological structure of Staphylococcus aureus and Escherichia coli

圖7中A為未經(jīng)樣品處理的金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)，其菌體細(xì)胞大小一致，呈葡萄狀排列；圖7中B為經(jīng)RGLF處理過的菌體形態(tài)，其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞，因此細(xì)胞大小不一，且出現(xiàn)了不同程度的皺縮。圖7中C為正常狀態(tài)下的大腸桿菌菌體形態(tài)，呈現(xiàn)典型的桿狀，兩端呈鈍圓形；圖7中D為加樣處理后的菌體形態(tài)，其發(fā)生了大面積的凹陷，有些細(xì)胞壁發(fā)生了破裂，內(nèi)容物滲漏。這些觀察結(jié)果表明RGLF可引起細(xì)菌菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌能夠造成明顯的內(nèi)部損傷。

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取法提取胭脂紅番石榴葉總黃酮的得率為6.04%，提取物經(jīng)AB-8大孔樹脂進一步純化后，所得樣品純度可達85.58%，表明AB-8大孔樹脂對番石榴葉黃酮有較好的純化效果，且超聲輔助提取法不失為一種較理想的方法。通過四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜分析，并與參考文獻比對及分子量相對誤差計算，從番石榴葉黃酮提取物中共鑒定出13種酚類化合物，包括槲皮素及其糖苷、楊梅素糖苷和兒茶素及原花青素二聚體等。番石榴葉黃酮提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有良好的抑制作用，其機制是通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和在胞內(nèi)產(chǎn)生了大量的ROS，致使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激而達到優(yōu)良的抑菌效果。在我國人工合成防腐劑的使用占大多數(shù)，若使用不當(dāng)，對人類的身體有一定的毒害作用，而胭脂紅番石榴葉黃酮提取物有較好的抑菌效果，因此，可以將其開發(fā)為綠色防腐劑，應(yīng)用在日常調(diào)味品中，既能增加食物的風(fēng)味和營養(yǎng)，又能達到防腐保鮮作用。