神經(jīng)絲蛋白輕鏈和磷酸化的神經(jīng)絲蛋白重鏈作為肌萎縮側(cè)索硬化生物標志物的研究進展

王靜雯，趙紅東，時建銓，劉婷婷

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種進行性發(fā)展的致死性神經(jīng)變性病，因其發(fā)病機制不明、異質(zhì)性高、無特異性生物標志物，所以早期診斷困難，大部分患者從發(fā)病至診斷需要近1年的時間[1]。近年來學(xué)者們不斷尋找診斷ALS的可靠生物標志物[2]，同時希望這些生物標志物能幫助我們客觀地監(jiān)測疾病進展程度、判斷預(yù)后。近來，CSF和血液中神經(jīng)絲蛋白輕鏈(NFL)和磷酸化的神經(jīng)絲蛋白重鏈(p-NFH)在ALS中的診斷作用逐漸得到重視，成為研究的熱點之一。神經(jīng)絲蛋白(NFs)是成熟神經(jīng)元軸突的主要細胞骨架蛋白之一，其在CSF和血液中的水平會隨著神經(jīng)軸突的損傷而升高，是一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在的生物標志物[3-5]。NFs可能與ALS的發(fā)病機制有關(guān)[6-7]。ALS患者NFL和p-NFH水平不僅顯著高于健康者及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者，具有診斷價值，而且高水平NFL和p-NFH還預(yù)示著疾病進展快、生存期短[3-4,8-9]。本文就CSF和血液NFL和p-NFH作為ALS生物標志物在其診斷、監(jiān)測疾病進展和判斷預(yù)后的研究進展綜述如下。

1 ALS概述

ALS多隱匿起病，發(fā)病率為0.01‰～0.02‰，缺乏有效治療，患者一般發(fā)病2～5年后因呼吸衰竭而死亡[1]。ALS以上運動神經(jīng)元(UMN)和下運動神經(jīng)元(LMN)的聯(lián)合變性為病理基礎(chǔ)，因起病部位隨機而存在不同的運動障礙表型，同時疾病擴展的方式及速度、UMN和LMN聯(lián)合變性的不同組合及多系統(tǒng)受累使本病具有高度臨床表型異質(zhì)性，導(dǎo)致早期誤診、漏診率高。近年來，學(xué)者們[10]在ALS影像學(xué)、電生理改變方面不斷有新的發(fā)現(xiàn)；在生物學(xué)方面，目前ALS發(fā)病機制仍不明確，可能涉及軸突運輸異常、細胞骨架異常、興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、異常蛋白聚集、神經(jīng)炎癥、線粒體障礙、基因突變等[11-12]。隨著這些發(fā)病機制的進一步明確，我們將對ALS有更全面的認識。眾多報道提示，CSF和血液中NFL和p-NFH是軸突損傷的標志物，也是目前最有前景的ALS生物標記物。

2 NFs介紹

NFs是神經(jīng)元特異性細胞骨架蛋白，屬于Ⅳ型中間絲，主要存在于直徑>5 μm的有髓軸突中，在穩(wěn)定軸突形態(tài)及直徑、維持軸突傳導(dǎo)速度中起重要作用[5-6]。根據(jù)亞基的相對分子質(zhì)量不同，NFs可分為NFL、神經(jīng)絲蛋白中鏈(NFM)、神經(jīng)絲蛋白重鏈(NFH)。這三種類型的NFs亞基均含有一個由310個氨基酸組成的中心α-螺旋桿狀域、一個可變的球形氨基(N-)頭端和羧基(C-)尾端[5,7]。

兩個神經(jīng)絲單體先二聚化形成α-螺旋卷曲螺旋，兩個二聚體再以交錯的反平行方式締合形成四聚體，四聚體亞基并排結(jié)合形成單位長度的長絲，然后端對端退火形成成熟的直徑約10 nm的神經(jīng)絲聚合物[5]。這些聚合物合成后再進行O-糖基化、硝化、氧化、泛素化、磷酸化等修飾。這些修飾對NFs的結(jié)構(gòu)及功能有著十分重要的作用，其中以磷酸化最為重要。磷酸化可以調(diào)節(jié)NFs之間的相互作用、影響軸突運輸、提高NF抗蛋白酶水解的能力，對NFL mRNA的穩(wěn)定性有一定的影響[13-14]。磷酸化的神經(jīng)絲主要存在軸突內(nèi)[8]，而NFM和NFH除了跟別的亞基一樣在N端被磷酸化以外，它們在C端還有大量的磷酸化位點，從而能夠被廣泛的磷酸化[5]。

30多年前，第一代免疫分析法證實了CSF和血液中NFs的存在，隨后又通過ELISA和增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)準確測定CSF和血液中的NFs水平。隨著第四代分析法SiMoA的出現(xiàn)，檢測精確度進一步提高，甚至可以發(fā)現(xiàn)血液NFL的生理性變化[5]。這也是近年來血液NFs研究越來越多的原因之一。

NFs與ALS相關(guān)。長期以來，NFs聚集體一直被認為是散發(fā)性和家族性ALS運動神經(jīng)元變性的特征性病理改變。目前NFs聚集的機制不明，過度磷酸化被認為是這種聚集體形成的主要原因之一[13]。有研究[13]認為，NFs聚集體引起神經(jīng)退行性變的原因是它阻礙了軸突的運輸。一項移除SOD1突變小鼠NFs尾部磷酸化區(qū)域結(jié)構(gòu)的研究[4]發(fā)現(xiàn)，移除后小鼠ALS進展的減緩，提示ALS發(fā)病后NFs的升高可能是對軸突運輸?shù)囊环N保護，目的是為了能夠恢復(fù)正常的軸突運輸。此外，有學(xué)者[14]認為，ALS也與NFL聚集體能促進超氧化物歧化酶(SOD1)蛋白聚集有關(guān)。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，Charcot-Marie-Tooth病2E亞型(CMT2E)患者的NF基因突變會導(dǎo)致NF代謝障礙而致病。這讓學(xué)者們意識到NF聚集體本身對運動神經(jīng)元變性的作用有限，更可能是由上游事件如NF亞單位的表達改變引起的NF結(jié)構(gòu)組裝異常導(dǎo)致的。其中，NFL mRNA的穩(wěn)定性改變與運動神經(jīng)元變性最為相關(guān)，但目前機制尚未明確[14-15]。

3 NFL和p-NFH的診斷價值

眾多研究[1,4,7,9,16-24]證實，ALS患者NFL和p-NFH水平顯著升高。這種升高在疾病早期就已經(jīng)出現(xiàn)[4,24]，可以用于ALS與健康人、類ALS及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的鑒別，且NFL和p-NFH水平與診斷延遲時間呈負相關(guān)[3,6,17]。NFL和p-NFH作為ALS的早期診斷生物標志物具有較高的敏感性和特異性[4,9,16,22]。因中樞神經(jīng)浸于CSF中，故CSF NFs水平較血液更高，診斷性能也更佳[1,8-9,17-18,24]。在區(qū)分ALS患者和健康人群時，CSF NFL的敏感性高達97%，特異性高達95%[9]。有研究[1]以CSF p-NFH 750 pg/ml為分界線區(qū)分ALS與臨床表現(xiàn)難以與ALS鑒別的其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病[神經(jīng)根/叢病、多灶性運動神經(jīng)病(MMN)、Kennedy病等]發(fā)現(xiàn)，其敏感性為92.9%，特異性為96%。對于那些剛出現(xiàn)癥狀但尚不符合ALS診斷標準的患者，可以在臨床檢查和EMG檢查的基礎(chǔ)上聯(lián)合NFs水平檢測，幫助ALS早期診斷。

NFL和p-NFH還可以作為ALS的預(yù)測指標。一項研究[24]指出，早在ALS患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前11.6個月時，其NFL水平就已經(jīng)開始升高。NFL是軸突中最多的亞基，當CNS軸突損傷后，很快就能檢測到血和CSF NFL水平的升高[6,19,22]。上述研究[24]提示，ALS神經(jīng)退行性病變可能早于臨床癥狀出現(xiàn)，檢測NFL水平有助于早期發(fā)現(xiàn)、量化這種疾病的亞臨床狀態(tài)，預(yù)測癥狀出現(xiàn)時間。Weydt等[25]發(fā)現(xiàn)，NFL和p-NFH水平在ALS患者出現(xiàn)癥狀后迅速上升了10倍。在未來，或許可以利用NFs的水平變化監(jiān)測高危人群(如攜帶C9orf72等突變基因的無癥狀患者)。若NFs水平突然出現(xiàn)上升，要考慮基因表型的轉(zhuǎn)化及臨床癥狀的出現(xiàn)，盡早開展治療。

一些研究發(fā)現(xiàn)，血液與CSF NFs水平之間[1,8-9,16,20,24,26]、血漿/CSF p-NFH和NFL水平之間[3,17,19,22,26]具有正相關(guān)性，因而可以用采集血液樣本的方法而代替腰椎穿刺，既降低了成本又安全便捷。

進一步研究NFL和p-NFH在ALS診斷中的優(yōu)缺點時發(fā)現(xiàn)：(1)因NFL易被蛋白酶降解，所以CSF p-NFH較CSF NFL診斷的敏感性更勝一籌[3,17,19]；(2)血液中p-NFH聚集可以引起“鉤狀效應(yīng)”[1,9,27]，導(dǎo)致免疫法測定時抗體結(jié)合位點減少，影響測量結(jié)果，降低了血液p-NFH指標的敏感性，因而血液NFL診斷性能更優(yōu)[26,28]。NFs水平可能與基因型有關(guān)。研究[29-30]表明，SOD1突變相關(guān)的ALS患者CSF NFL水平低于野生型ALS患者。Gendron等[31]的研究結(jié)果顯示，C9orf72突變患者的CSF p-NFH水平更高，與Huang等[26]研究結(jié)果一致。但值得注意的是，Huang的隊列中除了1例有C9orf72突變的患者病情進展速度較慢外，其余有C9orf72突變的患者疾病進展均較快，所以高水平NFs反映的是疾病進展速度還是基因突變本身帶來的影響尚不確定。但也有C9orf72或SOD1突變與血清NFL水平的相關(guān)性研究[4]得到了陰性結(jié)果。所以NFs與基因表型的關(guān)系還需進一步探討。

ALS診斷時要滿足“UMN、LMN同時受累”和“病情呈進行性發(fā)展”這兩大特點。通過臨床判斷UMN是否損害并不可靠，當LMN受累程度嚴重時，可完全掩蓋UMN受累的體征。此外，一些對錐體束有影響的疾病，如頸椎病等，難以與ALS區(qū)分，所以臨床迫切需要一種更加客觀、敏感的UMN受累的判定指標。一些研究[7,16,28,32-33]發(fā)現(xiàn)，NFL和p-NFH在判斷UMN受累中有一定的作用：以UMN損害為主的ALS，CSF p-NFH明顯高于UMN、LMN損害的典型ALS；臨床合并UMN受損表現(xiàn)的ALS，比單純以LMN受損為表現(xiàn)的患者NFs高；NFL水平也與UMN受累程度呈正相關(guān)。

NFs是軸突損傷的非特異性生物標志物。NFL水平會隨著衰老有一定程度的生理性升高[4-5]。中樞神經(jīng)軸突受損的疾病患者，如卒中、創(chuàng)傷性腦損傷、多發(fā)性硬化癥、多系統(tǒng)萎縮、創(chuàng)傷性腦損傷等，其NFs也會升高[4-5,20,23,28]。原發(fā)性側(cè)索硬化、遺傳性痙攣性截癱等UMN病也會有NFs水平的升高[18,21,28]。但ALS是一種快速進展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，其NFs水平顯著高于那些慢性起病、逐漸加重的疾病，如原發(fā)性側(cè)索硬化、遺傳性痙攣性截癱等。有研究[3]將ALS與急(亞急)性神經(jīng)元或以軸突損傷為主的疾病進行比較發(fā)現(xiàn)，NFs作為診斷生物標志物的可靠性是有限的。NFs需要與其他診斷手段相結(jié)合，來提高其診斷及預(yù)測的準確性和可靠性。同時，還可以通過聯(lián)合神經(jīng)炎癥、異常蛋白聚集等不同病理生理機制來源的生物標志物，提高診斷的敏感度和精確度[16,34-35]。目前，已有相關(guān)研究[29]發(fā)現(xiàn)了ALS患者NFs水平與皮質(zhì)脊髓束的DTI測量參數(shù)值——部分各向異性(FA)越低、徑向擴散率(RD)的相關(guān)性，并提出了NFs與影像學(xué)聯(lián)合診斷的可能性。

4 NFL和p-NFH用于監(jiān)測疾病進展

臨床上通常用ALS功能評分量表(ALSFRS-R)評價疾病進展的速度，ALSFRS-R評分下降越快，提示病情進展越快。有研究[1,3-4,6,8-9,17,22,26,28,32]發(fā)現(xiàn)，NFs水平越高，病程越短，疾病進展越快。但NFs在整個病程中的變化是很復(fù)雜的，其與病程的關(guān)系受到諸多因素的影響，所以還需結(jié)合NFs的動態(tài)變化評價病情進展的情況[23,27]。在ALS病程中，NFL和p-NFH水平在早期一定時間內(nèi)進行性升高[17,21-24]。這種早期升高的原因還無定論，一方面可能與ALS疾病早期病情進展較快，快速的軸突病變導(dǎo)致NFs水平升高有關(guān)；另一方面可能是隨著病情發(fā)展，受累的軸突數(shù)量增多導(dǎo)致的[23]。還有學(xué)者[23,27]提出，疾病進展快、生存期較短的患者，其早期p-NFH水平就達到峰值，隨著存活的神經(jīng)元越來越少，疾病后期p-NFH反而會降低；反之，進展慢、生存期較長的患者中p-NFH水平會隨著變性程度的加重而慢慢升高。

同一種生物標志物在同一患者的不同階段中保持相對穩(wěn)定才能滿足臨床可重復(fù)測量的要求。多數(shù)研究認為，CSF p-NFH水平[8,17,26]、CSF和血液中NFL[4,6,9,24,26]水平能夠保持相對穩(wěn)定。一些血液樣本的數(shù)據(jù)[27]提示，血液p-NFH水平穩(wěn)定性稍差。一項長達15個月的隨訪研究[9]發(fā)現(xiàn)，NFL水平在快、中、慢ALS進展組中的變化是不同的，各組血漿NFL水平均無顯著增高，快進展組血清NFL水平顯著增高，快進展組、慢進展組CSF NFL水平顯著增高。另外，各組增加的速度也不一致。Posen等[17]也發(fā)現(xiàn)，不同進展組的NFs水平變化不一致。Boylan等[8]在為期12個月的隨訪中發(fā)現(xiàn)，隨訪4個月后血液p-NFH水平與ALSFRS-R的下降快慢程度無明顯相關(guān)性，提示血液NFs指標與臨床的相關(guān)性不如CSF NFs。這些研究結(jié)果還不能完全被解釋，但與以下因素密不可分：(1)NFs的水平受到自身聚集、降解、自身抗體免疫反應(yīng)等影響；(2)血液和CSF中NFs水平的代謝機制不完全一樣；(3)ALS的病理生理機制、運動細胞丟失動力學(xué)機制尚未明確[27]；(4)統(tǒng)計學(xué)方法以及檢驗手段具有差異。

5 NFL和p-NFH用于判斷預(yù)后

研究[1,3-4,7-9,16,22-23,26,28]指出，ALS患者NFs水平與生存時間呈負相關(guān)，NFL和p-NFH越高，生存時間就越短，預(yù)后越差。CSF和血液NFL、CSF p-NFH是ALS獨立的生存預(yù)測因子[9,18,28,36]，可用于判斷ALS的預(yù)后[16,22]。但有研究[27]提示，血漿p-NFH對預(yù)后的預(yù)測價值有限。ALS患者預(yù)后受起病年齡、起病部位、呼吸肌受累情況等因素的影響[12,36]。多數(shù)研究[3-4,6-7,17,19,23,32]未發(fā)現(xiàn)NFL、p-NFH水平與起病部位相關(guān)，但有研究[8,20]發(fā)現(xiàn)球部起病的ALS患者比肢體起病患者的p-NFH水平更高。2014年Tortile等[37]首次提出了“泛化時間(TTG)”的概念，指癥狀從起病部位到累及全身的時間。TTG越短提示疾病的侵襲性越高，預(yù)后越差；初始CSF NFL水平越高，TTG越短。Li等[20]也在中國人群中發(fā)現(xiàn)了CSF和血漿p-NFH與預(yù)后的類似關(guān)系。Gendron等[31]認為，CSF中的p-NFH不僅是散發(fā)型ALS較好的預(yù)后預(yù)測指標，也是攜帶C9orf72基因突變的ALS患者較好的預(yù)后預(yù)測指標。ALS患者NFs水平不受年齡、性別以及利魯唑治療的影響[3-4,6,9,23-24]，提示NFs與臨床因素更為相關(guān)，肯定了NFs作為ALS生物標志物的價值。

6 展望

綜上所述，ALS患者NFL和p-NFH水平顯著升高，在診斷、監(jiān)測疾病進展及判斷預(yù)后中有一定的應(yīng)用價值。但NFs進入臨床使用前還有許多問題需要解決，如制定標準化檢測方法，使數(shù)據(jù)具有可比性，以及統(tǒng)一NFs的參考值等。需注意的是，有諸多研究發(fā)現(xiàn)Alzheimer’s病的tau蛋白病以及其他神經(jīng)變性病也有這些生物標志物變化，對此標志物的特異性、相關(guān)疾病的cutoff值等還需進一步探討確定。盡管如此，NFL和p-NFH仍然是目前ALS最有前景的生物診斷標志物之一，相信隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合電生理、基因檢測等方法，將有助于進一步研究ALS的發(fā)生、發(fā)展機制。