干眼中結(jié)膜杯狀細(xì)胞及其分泌的黏蛋白的變化

王振宇

隨著社會的發(fā)展和視頻終端的使用，干眼越來越成為影響人們身心健康的眼科常見疾病之一。世界范圍內(nèi)，約有四分之一的眼科患者會主訴與干眼相關(guān)的各種眼部不適。根據(jù)2017年TFOS DEWS II的定義，干眼是一種多因素疾病，以持續(xù)的淚膜不穩(wěn)定為特征，引起眼部不適與視覺損傷，同時伴有不同程度的角膜上皮疾病及炎癥[1]。正常眼表淚膜可分為三層，即表面的脂質(zhì)層，中間的水液層和底面的黏蛋白層。結(jié)膜杯狀細(xì)胞及其分泌的黏蛋白，在維持淚膜穩(wěn)定及角膜上皮完整性上具有重要作用，成為干眼研究的一個重要領(lǐng)域。研究表明，年齡、眼表炎癥、淚液高滲透壓、局部藥物毒性等多種情況都可導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細(xì)胞的丟失或功能異常，以及黏蛋白分泌的減少，造成淚膜穩(wěn)定性下降和角膜上皮損傷，從而加重干眼的惡性循環(huán)。

一、結(jié)膜杯狀細(xì)胞的生理特性

正常結(jié)膜是一個富含杯狀細(xì)胞的粘膜組織，人類的杯狀細(xì)胞通常散在分布，但在鼻側(cè)有聚集[2]。淚液中的生長因子EFG及Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-13等因子具有促進(jìn)杯狀細(xì)胞的增殖以及蛋白合成的作用，而膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)可以刺激杯狀細(xì)胞反射性地分泌黏蛋白[3，4]。結(jié)膜杯狀細(xì)胞表達(dá)黏蛋白基因MUC5AC、MUC5B和MUC2，其中人類淚液中主要為黏蛋白MUC5AC[5]。黏蛋白具有維持眼表水潤、淚液穩(wěn)定等作用，還能夠協(xié)助清除外界病原體和組織碎片[6，7]。角膜上皮會產(chǎn)生與細(xì)胞膜錨定的黏蛋白MUC1、MUC4和MUC16，目前還不清楚分泌的黏蛋白是否與角膜上皮錨定的黏蛋白產(chǎn)生相互粘附。

除了分泌黏蛋白，杯狀細(xì)胞還是結(jié)膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分。杯狀細(xì)胞能夠跨越2～3層上皮細(xì)胞的厚度，使它可以作為抗原傳遞者，將眼表的抗原傳遞給結(jié)膜基質(zhì)中的單核巨噬細(xì)胞[8]。杯狀細(xì)胞還能產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子，如TGF-β和維甲酸等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[9]。同時杯狀細(xì)胞還是眼表固有免疫的主要成分，能夠產(chǎn)生可溶性黏蛋白、三葉肽因子、防衛(wèi)素和其他抗菌成分，阻止外界微生物的入侵[10，11]。呼吸道中的杯狀細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)膜杯狀細(xì)胞是否有相同的功能還不清楚，但如果結(jié)膜杯狀細(xì)胞缺失或者黏蛋白分泌減少會加重眼表炎癥反應(yīng)[12]。

杯狀細(xì)胞與鄰近結(jié)膜上皮細(xì)胞間的緊密連接由成孔連接蛋白2和成孔連接蛋白10組成，從而形成能夠“滲漏”的結(jié)膜上皮，方便調(diào)節(jié)細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運[13]。交感神經(jīng)能夠刺激結(jié)膜鱗狀上皮細(xì)胞復(fù)層，對于杯狀細(xì)胞的作用不明，而副交感神經(jīng)能夠刺激杯狀細(xì)胞分泌，對于旁邊的復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞沒有明顯影響。生長因子、乙酰膽堿、組胺和前列腺素能夠刺激杯狀細(xì)胞來源的黏蛋白，而對于結(jié)膜上皮細(xì)胞的作用不清楚[14，15]。因此，結(jié)膜中不同細(xì)胞的特異性分化及功能調(diào)節(jié)，仍然需要大量的研究工作來闡明。

之前的研究表明，結(jié)膜細(xì)胞譜系與角膜上皮譜系并不完全相同，結(jié)膜杯狀細(xì)胞是有增殖能力的慢循環(huán)細(xì)胞，在穹窿區(qū)杯狀細(xì)胞和角化細(xì)胞擁有共同的雙能祖細(xì)胞，這些提示杯狀細(xì)胞可能存在前體細(xì)胞或干細(xì)胞，這些具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群在眼表廣泛分布，但在內(nèi)眥部和下穹窿區(qū)更密集[16，17]。在角膜緣干細(xì)胞缺乏中，能夠觀察到含有不同數(shù)目的增殖細(xì)胞、慢循環(huán)角膜祖細(xì)胞和有絲分裂后杯狀細(xì)胞的復(fù)合體從角膜緣區(qū)域向角膜中央遷移，最終在眼表形成更多的杯狀細(xì)胞[18]。因此，為了更好研究及改善干眼的治療，有必要尋找可靠的杯狀細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物，以及杯狀細(xì)胞分化的調(diào)控機制。

二、干眼對杯狀細(xì)胞的影響

干眼中眼表長期存在炎癥反應(yīng)，會導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量的減少，同時黏蛋白MUC5AC和其他杯狀細(xì)胞的產(chǎn)物也同等比例的減少[19]，且杯狀細(xì)胞的減少與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)，杯狀細(xì)胞的丟失也與OSDI量表測量的眼表刺激癥狀呈正相關(guān)[24]。但到目前為止，干眼炎癥反應(yīng)導(dǎo)致杯狀細(xì)胞減少的確切機制還不完全清楚。在兔干眼模型中，去除干眼誘導(dǎo)因素，杯狀細(xì)胞的減少和其他干眼體征仍然持續(xù)了兩周[20]。TNF-α、IFN-γ等炎癥因子是導(dǎo)致杯狀細(xì)胞數(shù)量和分泌減少的關(guān)鍵因子[21]。相反，暴露于過敏環(huán)境中能夠刺激杯狀細(xì)胞的存活、增殖和分泌。組胺、白介素、前列腺素和其他過敏因子刺激了黏蛋白的分泌，但具體機制也不完全清楚[22]。通過轉(zhuǎn)錄因子SPDEF，自然殺傷T細(xì)胞來源的IL-13能夠上調(diào)杯狀細(xì)胞的數(shù)量，誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞分化[23]。在部分干眼模型中發(fā)現(xiàn)，淚液的高滲透壓也造成了結(jié)膜杯狀細(xì)胞的丟失。這些研究表明，對于不同的外部環(huán)境和特定物質(zhì)的刺激，結(jié)膜杯狀細(xì)胞的反應(yīng)并不相同。

Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞來源的IFN-γ能夠引起杯狀細(xì)胞分泌功能障礙，誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致杯狀細(xì)胞的凋亡[25，26]。在淚液缺乏性干眼，特別是Sj?gren綜合征中，可以發(fā)現(xiàn)結(jié)膜中IFN-γ以及其誘導(dǎo)的趨化因子CXCL-10的增加，同時淚液中IFN-γ等細(xì)胞因子的濃度也明顯升高[27，28]。研究還表明，在免疫缺陷小鼠中，轉(zhuǎn)移的CXCR3+CD4+ T細(xì)胞由于眼表干燥壓力產(chǎn)生的IFN-γ，引起杯狀細(xì)胞的廣泛死亡。APC細(xì)胞導(dǎo)致淚液中IL-12增加，刺激T細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ介導(dǎo)趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11等，導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細(xì)胞丟失，從而形成一個自增強的炎癥循環(huán)。

臨床前期的研究表明，能夠抑制干眼、減少細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)的治療方法，也能夠增加結(jié)膜杯狀細(xì)胞的密度。FDA批準(zhǔn)的CsA三期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，CsA治療水樣缺乏性干眼6個月后，結(jié)膜杯狀細(xì)胞的密度明顯增加，Sj?gren's綜合征患者中增加198%，非Sj?gren's綜合征患者中增加234%[29]。糖皮質(zhì)激素(氟米龍)和維生素A治療干眼的臨床研究中，也發(fā)現(xiàn)了結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度的增加[30，31]。FDA最新批復(fù)的治療干眼新藥，LFA-1拮抗劑立菲斯特，在小鼠干眼模型中也發(fā)現(xiàn)能夠增加結(jié)膜杯狀細(xì)胞的密度，但在人類的臨床試驗中尚無類似的研究報道[32]。

年齡一直是干眼的危險因素之一，大的流行病學(xué)調(diào)查顯示，50歲之后，男性和女性干眼的發(fā)病率顯著提高，尤其以女性顯著[33，34]。相關(guān)的年齡改變包括淚河高度、淚液中炎癥因子增加、角膜神經(jīng)密度降低等，同時多個組織中炎癥標(biāo)記物IL-6、TNF-α和IFN-γ等也隨著年齡增加，稱之為炎性老化[35，36]。這些炎癥介質(zhì)中，IFN-γ因為能夠促進(jìn)角膜、結(jié)膜和淚腺的凋亡而顯得尤為重要。在老化的小鼠結(jié)膜中，發(fā)現(xiàn)了CD4+ T細(xì)胞的增加和杯狀細(xì)胞的減少，而在IFN-γ缺陷小鼠中，與年齡相關(guān)的杯狀細(xì)胞的丟失明顯減少了[37，38]。老化結(jié)膜中其他的危險因素還包括APC細(xì)胞的啟動、病理性Th1細(xì)胞等，這些都引起年齡相關(guān)的杯狀細(xì)胞的減少。

三、干眼中黏蛋白的改變

干眼中結(jié)膜杯狀細(xì)胞的丟失首先引起黏蛋白分泌的減少。干眼患者的淚液中，黏蛋白MUC5AC的濃度降低，但研究顯示干眼患者中MUC5AC基因的表達(dá)沒有變化或者上升了[39，40]，這種差異主要源于干眼的嚴(yán)重程度不同?；虮磉_(dá)的上調(diào)可能是對黏蛋白分泌下降的代償性調(diào)節(jié)，但也有研究注意到，干眼患者中MUC2基因表達(dá)下調(diào)了。在干眼病理過程中，也發(fā)生了黏蛋白糖基化的改變，在一部分沒有干眼體征但有干眼癥狀的患者中有黏蛋白MUC2和MUC5AC糖基化的改變，MUC2和MUC5AC在維持淚液流體力學(xué)特性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[41，42]。

在干眼患者中，還發(fā)現(xiàn)了膜相關(guān)黏蛋白基因MUC1、MUC4和MUC16表達(dá)的降低。這些黏蛋白是糖萼的主要成分，其表達(dá)的減少會導(dǎo)致眼表保護功能降低，眼表潤滑作用也會相應(yīng)降低[43，44]。MUC1糖基化的改變，在輕到中度患者中，主要表現(xiàn)為MUC1唾液酸化增加，而在重度患者中，主要表現(xiàn)為MUC1唾液酸化減少[45]。

研究發(fā)現(xiàn)，Sj?gren’s綜合征患者中，MUC5AC基因表達(dá)降低，同時淚液中MUC5AC的濃度也下降了，還有報道發(fā)現(xiàn)Sj?gren’s綜合征中的MUC19基因表達(dá)和終產(chǎn)物也下降了[46]。另一方面，Sj?gren’s綜合征患者中淚液中可溶性MUC16的濃度升高了，但結(jié)膜組織中膜結(jié)合MUC16沒有明顯變化[47]。而有研究顯示，無論淚液中可溶性MUC1還是結(jié)膜組織中膜結(jié)合MUC1，在Sj?gren’s綜合征患者中都增加了[48]。研究者認(rèn)為無論黏蛋白MUC1還是MUC16的升高都是一個代償反應(yīng)，這樣可以維持干眼狀態(tài)下眼表的功能。

四、促進(jìn)杯狀細(xì)胞恢復(fù)的方法

在結(jié)膜或杯狀細(xì)胞遭受損害后，自體健康結(jié)膜組織移植是恢復(fù)眼表和結(jié)膜功能的一個理想方法，但很多時候并不可行，于是研究者一直在尋找其他可替代的粘膜組織移植?？谇徽衬ひ子讷@取，但其不含杯狀細(xì)胞，不利于淚膜恢復(fù)。羊膜組織具有很好的抗炎作用，而且有利于結(jié)膜上皮化，廣泛應(yīng)用于眼表重建。結(jié)膜細(xì)胞目前可以在體外支架材料上培養(yǎng)，這為嚴(yán)重的結(jié)膜損傷患者提供了移植材料。結(jié)膜下成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，促進(jìn)了結(jié)膜祖細(xì)胞的生長。在角膜緣干細(xì)胞缺乏時，往往也伴有杯狀細(xì)胞的大量丟失，此時自體或親屬的角膜緣組織移植可以提供大量的角膜緣干細(xì)胞。在炎癥誘導(dǎo)的干眼模型中，眶周注射間充質(zhì)干細(xì)胞后，眼表炎癥因子的表達(dá)和CD4+ T細(xì)胞的浸潤減少了，而淚液分泌和杯狀細(xì)胞的數(shù)量增加了[49]。

研究發(fā)現(xiàn)，溶解素能夠終止干眼中的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白，因此可能成為治療干眼的一個新的方向[50]。溶解素D1通過磷脂酶A2、C、D，ERK1/2，鈣離子/鈣調(diào)蛋白促進(jìn)杯狀細(xì)胞分泌，保護黏蛋白層，維持眼表穩(wěn)態(tài)[51]。溶解素D2能夠上調(diào)cAMP，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，促進(jìn)杯狀細(xì)胞分泌功能[52]。溶解素D1和E1能夠阻止鈣內(nèi)流，活化ERK1/2，控制炎癥環(huán)境中白三烯對杯狀細(xì)胞分泌的刺激[53]。這些研究都表明，溶解素可能成為杯狀細(xì)胞有效的調(diào)節(jié)劑，值得進(jìn)一步關(guān)注。

Notch信號通路在腸道上皮分泌型或吸收型細(xì)胞的形成過程中起著決定性作用，可以通過信號通路引導(dǎo)細(xì)胞向特定方向分化，誘導(dǎo)結(jié)膜存在的干細(xì)胞向杯狀細(xì)胞分化，從而增加結(jié)膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量。通過阻斷Notch級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致小腸中增殖性的隱窩細(xì)胞向有絲分裂后的杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變[54]。在腸道或結(jié)膜中條件性地去除Notch調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子KLF4后，杯狀細(xì)胞就停止發(fā)育了[55]。而抑制Notch信號通路可以增加KLF4的表達(dá)、促進(jìn)杯狀細(xì)胞分化以及減少腫瘤浸潤和增生，說明Notch信號通路和KLF4存在相互調(diào)控[56]。通過上述結(jié)果可以預(yù)測，抑制結(jié)膜上皮細(xì)胞的Notch信號通路將促進(jìn)杯狀細(xì)胞的形成。需要注意的是，在角膜上皮細(xì)胞不可逆的失活Notch-1后，導(dǎo)致了角化增生，形成了一個血管化的不透明斑塊[57]。

近期有報道稱在小梁切除造成的結(jié)膜損傷中，活化CXCR3趨化因子受體增加了結(jié)膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量，手術(shù)后在兔眼結(jié)膜下注射活化的趨化因子也增加了杯狀細(xì)胞的數(shù)量。杯狀細(xì)胞增加的具體機制還沒有闡明，但可能與兩方面有關(guān)，一是直接作用于杯狀細(xì)胞前體細(xì)胞，二是通過調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境產(chǎn)生間接作用，因為白內(nèi)障術(shù)后抑制炎癥反應(yīng)可以保留更多的杯狀細(xì)胞[58]。M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CXCR3的配體CXCL10，是應(yīng)對損傷的生理反應(yīng)之一，能夠在炎癥早期或者死亡配體存在的情況下保護前體細(xì)胞或干細(xì)胞[59]。盡管這方面研究尚淺，但也說明控制干眼的炎癥反應(yīng)將有效挽救杯狀細(xì)胞。

五、小結(jié)

隨著研究深入，杯狀細(xì)胞在干眼中的作用受到更多重視。不僅其分泌的黏蛋白是組成淚膜的重要成分，而且杯狀細(xì)胞還發(fā)揮著調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運等作用。雖然干眼中各種機制會導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細(xì)胞的丟失、分泌黏蛋白的減少，以及分泌的黏蛋白發(fā)生糖基化改變，加劇了干眼的惡性循環(huán)。但杯狀細(xì)胞前體細(xì)胞存在的可能性，和提高杯狀細(xì)胞數(shù)量的實驗基礎(chǔ)，為挽救杯狀細(xì)胞提供了理論依據(jù)。結(jié)膜組織、角膜緣組織或各種干細(xì)胞移植，發(fā)揮溶解素對杯狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，調(diào)控杯狀細(xì)胞分化的信號通路，改善眼部炎癥反應(yīng)微環(huán)境等方法，都將成為未來治療干眼的可能方向。