山藥及麩炒山藥拉曼指紋圖譜分析

彭 艷，張麗穎，金 陽(yáng)，楊 釗，陸兔林，金傳山，都述虎*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166；2.九州天潤(rùn)中藥產(chǎn)業(yè)有限公司，湖北 武漢 430040；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖，記載于《山海經(jīng)》《神農(nóng)本草經(jīng)》《圖經(jīng)本草》《本草綱目》《植物名實(shí)圖考》等中醫(yī)藥典籍中[1]。山藥味甘，性平，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精的功效。2020年版《中國(guó)藥典》記載的山藥飲片主要有生山藥和麩炒山藥，其鑒定僅局限在性狀、顯微和薄層色譜鑒別，主要是針對(duì)山藥的真?zhèn)舞b別，但對(duì)于不同產(chǎn)地山藥之間的差異，特別是對(duì)山藥炮制前后的化學(xué)成分變化研究甚少，給山藥質(zhì)量控制帶來(lái)了很大的困難。因此，發(fā)展一種快速簡(jiǎn)便的分析方法，對(duì)山藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升具有重要意義。

拉曼光譜是一種散射光譜，通過(guò)散射峰的位置和強(qiáng)度得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面的信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究。隨著拉曼光譜技術(shù)發(fā)展，拉曼光譜的應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越廣泛，作為一種現(xiàn)代光學(xué)檢測(cè)分析技術(shù)被2020年版《中國(guó)藥典》四部通則收錄。近幾年來(lái)，拉曼光譜以其操作簡(jiǎn)便、精細(xì)如“指紋”的分辨能力和不受水分干擾等優(yōu)點(diǎn)成功應(yīng)用于中藥材的無(wú)損定性鑒別[2-7]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地的山藥飲片及其麩炒前后的拉曼指紋圖譜進(jìn)行分析，以期為麩炒前后山藥的質(zhì)量控制提供新途徑。

1 材料

DXR激光共聚焦拉曼光譜儀(美國(guó)賽默飛公司)。山藥對(duì)照藥材(批號(hào)121137-201606)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；可溶性淀粉(分析純，批號(hào)20191213)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。山藥及麩炒山藥選片、統(tǒng)片(產(chǎn)地河南)由湖北麻城九州中藥發(fā)展有限公司提供，其余山藥飲片購(gòu)自河南、河北、廣西及安徽，見(jiàn)表1。山藥片經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院陳立娜教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖切制而成。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 拉曼光譜條件 掃描范圍2 000～400 cm-1；10倍物鏡；激光功率24 mW，激發(fā)波長(zhǎng)780 nm；狹縫光闌50 μm，曝光時(shí)間10 s，累積10次。

2.2 測(cè)定方法 檢測(cè)時(shí)將樣品平面置于載玻片上，使其位于拉曼光譜儀載物臺(tái)的物鏡下測(cè)定，按采集參數(shù)隨機(jī)采集樣品的拉曼光譜，計(jì)算平均光譜用于分析比較。

2.3 拉曼光譜條件優(yōu)化 為獲得最佳山藥拉曼光譜圖，分別對(duì)拉曼光譜儀的激發(fā)波長(zhǎng)、光闌類(lèi)型、激光功率、曝光時(shí)間和累積次數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。

2.3.1 激發(fā)波長(zhǎng)選擇 取山藥對(duì)照藥材顆粒適量，固定激光功率24 mW，狹縫光闌25 μm，曝光時(shí)間2 s，累積10次，按“2.2”項(xiàng)下方法分別在532、633、780 nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，780 nm激發(fā)波長(zhǎng)下山藥對(duì)照藥材的基線(xiàn)噪音最小，峰形最好，因此使用該波段激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定，能夠有效避免熒光對(duì)樣品拉曼信號(hào)的影響。故選擇780 nm為最佳激發(fā)波長(zhǎng)。

2.3.2 光闌類(lèi)型選擇 取山藥對(duì)照藥材顆粒適量，固定激光功率24 mW，激發(fā)波長(zhǎng)780 nm，曝光時(shí)間2 s，累積10次，按“2.2”項(xiàng)下測(cè)定方法，分別在針孔光闌(25、50 μm)和狹縫光闌(25、50 μm)下進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果顯示拉曼光譜儀的光闌類(lèi)型對(duì)山藥光譜影響較大，狹縫光闌下光譜的分辨率明顯高于針孔光闌，且隨著狹縫寬度增大，光譜強(qiáng)度增強(qiáng)。因此本實(shí)驗(yàn)中最后選擇50 μm狹縫光闌進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 激光功率選擇 取山藥對(duì)照藥材顆粒適量，固定激發(fā)波長(zhǎng)780 nm，光闌50 μm，曝光時(shí)間2 s，累積10次，按“2.2”項(xiàng)下測(cè)定方法，分別在8、16、24 mW激光功率下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示激光功率越大，拉曼峰強(qiáng)度越強(qiáng)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)激光功率選擇24 mW。

2.3.4 曝光時(shí)間選擇 取山藥對(duì)照藥材顆粒適量，固定激光功率24 mW激發(fā)波長(zhǎng)780 nm，光闌50 μm，累積10次，按“2.2”項(xiàng)下測(cè)定方法，分別曝光2、5、10 s對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示光譜采集時(shí)的曝光時(shí)間越長(zhǎng)，拉曼峰強(qiáng)度越強(qiáng)，信噪比值越大，當(dāng)積分時(shí)間為10 s時(shí)山藥對(duì)照藥材的拉曼特征峰峰形最好，基線(xiàn)噪音較小，再提高曝光時(shí)間，譜圖沒(méi)有明顯改善，且損害激光器的使用壽命，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)曝光時(shí)間選擇10 s。

2.3.5 累積次數(shù)選擇 取山藥對(duì)照藥材顆粒適量，固定激光功率24 mW激發(fā)波長(zhǎng)780 nm，光闌50 μm，曝光時(shí)間10 s，按“2.2”項(xiàng)下測(cè)定方法，分別累積2、5、10次進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示隨著累積次數(shù)的增加，山藥對(duì)照藥材的拉曼光譜圖基線(xiàn)噪音會(huì)越來(lái)越小，但累積次數(shù)過(guò)多會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)時(shí)間，損害儀器壽命，綜合考量確定累積次數(shù)為10次。

2.4 山藥拉曼峰歸屬 取山藥對(duì)照藥材顆粒適量，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行檢測(cè)，選取6個(gè)不同點(diǎn)進(jìn)行掃描，得到的山藥拉曼光譜峰形、峰強(qiáng)度均相對(duì)穩(wěn)定，見(jiàn)圖1。在山藥對(duì)照藥材拉曼光譜中，478、866、941、1 460 cm-1處出現(xiàn)明顯的特征峰；440、523、577、616、713、770、1 050、1 082、1 126、1 263、1 339、1 380 cm-1處出現(xiàn)較明顯的拉曼峰。這些拉曼峰反映了山藥拉曼光譜的指紋特性。和可溶性淀粉比較，發(fā)現(xiàn)山藥對(duì)照藥材與可溶性淀粉的拉曼特征峰峰形相似，見(jiàn)圖2。

圖1 山藥對(duì)照藥材拉曼光譜 (n=6)Fig.1 Raman spectra of Chinese yam for control (n=6)

圖2 山藥對(duì)照藥材與可溶性淀粉拉曼光譜比較Fig.2 Comparison of Raman spectra between Chinese yam for control and soluble starch

查閱文獻(xiàn)[8-10]，可知800～400 cm-1處的振動(dòng)是由于糖苷環(huán)骨架的彎曲振動(dòng)所造成，其中478 cm-1處的峰是由吡喃糖環(huán)的骨架振動(dòng)引起，常作為直鏈淀粉與支鏈淀粉即淀粉多糖特征峰，另外其峰強(qiáng)度反映了多糖的聚合程度；770 cm-1處的峰是由N-甲基甲酰胺的C-C伸縮振動(dòng)引起(可能有尿囊素)；1 200～800 cm-1處的振動(dòng)是C-O和C-C鍵的特征伸縮振動(dòng)以及糖苷鍵中C-O-C的彎曲振動(dòng)，其中866 cm-1處的峰來(lái)源于C-O-C環(huán)和C-H彎曲振動(dòng)，941 cm-1處的振動(dòng)是由于直鏈淀粉α-1,4糖苷鍵的C-O-C的彎曲振動(dòng)引起。1 500～1 200 cm-1處的振動(dòng)源于氫原子的耦合，其中1 263 cm-1處與CH2OH側(cè)鏈相關(guān)，1 339 cm-1處為C-O-H彎曲振動(dòng)，1 380 cm-1為CH2、C-H和C-O-H的彎曲振動(dòng)，1 460 cm-1處為CH2的彎曲振動(dòng)。實(shí)驗(yàn)所獲得的山藥拉曼光譜峰信號(hào)，顯示了山藥中淀粉的指紋特性[8-11]。山藥對(duì)照藥材拉曼光譜特征峰振動(dòng)模式歸屬，見(jiàn)表2。

表2 拉曼光譜譜峰位置及歸屬Tab.2 Positions and their assignments of Raman peaks for Chinese yam for control

2.5 拉曼顯微成像分析 取山藥選片1片置于樣品臺(tái)，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行面掃描，X軸步距為2 000 μm，Y軸步距為3 500 μm，共40個(gè)掃描點(diǎn)。以478 cm-1處特征峰強(qiáng)度繪制mapping圖，結(jié)果見(jiàn)圖3，掃描范圍內(nèi)山藥選片表面各檢測(cè)點(diǎn)的峰強(qiáng)度均一性較好，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可在樣品表面隨機(jī)采樣收集光譜信息。

圖3 478 cm-1處山藥選片面掃描圖Fig.3 Raman mapping image of selected Chinese yam with Raman band at 478 cm-1

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取山藥選片5片，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下，分別在5個(gè)片子中心表面進(jìn)行拉曼檢測(cè)，5組山藥特征峰強(qiáng)度的RSD小于4.0%，拉曼位移RSD小于0.1%。

2.7 不同產(chǎn)地山藥拉曼光譜分析 在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下，分別對(duì)河南、河北、廣西、安徽不同產(chǎn)地的山藥飲片進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，得到拉曼光譜圖。圖4顯示，所有山藥樣品在400～1 500 cm-1的光譜范圍內(nèi)均出現(xiàn)了明顯的指紋特征峰，不同產(chǎn)地的山藥飲片指紋圖譜比較基本一致，且不同產(chǎn)地山藥拉曼光譜峰差異不大，較難區(qū)分。為進(jìn)一步擴(kuò)大山藥拉曼光譜之間的差異，對(duì)各產(chǎn)地山藥拉曼光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)化處理，見(jiàn)圖5～6。綜上結(jié)果提示，僅憑拉曼光譜很難區(qū)分不同產(chǎn)地山藥的差異。

圖4 不同產(chǎn)地山藥與可溶性淀粉的拉曼光譜Fig.4 Raman spectra of Chinese yam from different areas and soluble starch

圖5 不同產(chǎn)地山藥的拉曼光譜一階導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)換Fig.5 First derivative transformations of Raman spectra of Chinese yam from different areas

圖6 不同產(chǎn)地山藥的拉曼光譜二階導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)換Fig.6 Second derivative transformations of Raman spectra of Chinese yam from different areas

2.8 判別分析 采用TQ Analyst軟件(7.2.2.161版本)對(duì)河南、河北、廣西、安徽四個(gè)產(chǎn)地的山藥飲片拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析，以馬氏距離單位計(jì)算各樣品與各類(lèi)中心之間的距離，并根據(jù)樣品與中心距離的遠(yuǎn)近做出判別，以確定樣品屬于哪一個(gè)類(lèi)別。距離值越接近零，則匹配越好。采用全模型法，選擇山藥拉曼光譜指紋區(qū)間400～1 500 cm-1，對(duì)不同產(chǎn)地山藥進(jìn)行判別分析，每個(gè)產(chǎn)地的山藥飲片取10個(gè)樣本量，分析圖中，橫坐標(biāo)為樣本距離河南組的馬氏距離，縱坐標(biāo)為樣本距離廣西組的馬氏距離，見(jiàn)圖7。結(jié)果顯示，廣西山藥樣本單獨(dú)聚為一類(lèi)，能夠很好地與河南、河北和安徽山藥區(qū)分開(kāi)來(lái)。即通過(guò)判別分析可以有效區(qū)分廣西山藥和其他3個(gè)產(chǎn)地山藥。

圖7 不同產(chǎn)地山藥判別分析結(jié)果Fig.7 Results of discriminant analysis for Chinese yam from different areas

2.9 麩炒山藥拉曼光譜分析 取麩炒山藥飲片，對(duì)其表面和截面進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8～9，麩炒山藥飲片表面拉曼光譜熒光背景較強(qiáng)，478 cm-1處的特征峰是直鏈淀粉與支鏈淀粉多糖成分的有效標(biāo)志，強(qiáng)度顯著降低，在468、491 cm-1處出現(xiàn)2個(gè)新的拉曼散射峰，分別為葡萄糖吡喃糖環(huán)的骨架振動(dòng)。為進(jìn)一步分析478 cm-1處特征峰強(qiáng)度麩炒前后的變化，分別取山藥及麩炒山藥飲品各6片，進(jìn)行拉曼光譜掃描，并根據(jù)其峰強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示山藥麩炒前后峰強(qiáng)度降低約80%，見(jiàn)表3，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的總淀粉含量降低值接近，提示山藥在麩炒過(guò)程中，飲片表面的淀粉多糖發(fā)生了降解，多糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖[12-13]，即表明山藥麩炒前后表面多糖含量及單糖組成存在差異。同時(shí)將麩炒山藥飲片切開(kāi)取截面平掃，麩炒山藥截面拉曼光譜圖和同批生山藥拉曼光譜圖相比，峰位移和峰強(qiáng)度沒(méi)有太多變化，可見(jiàn)麩炒山藥內(nèi)部淀粉含量沒(méi)有變化。

圖8 山藥選片和麩炒山藥選片表面與截面拉曼光譜比較Fig.8 Comparison of Raman spectra obtained on surface and cross-section of selected Chinese yam and Chinese yam stir-fried with bran

圖9 山藥統(tǒng)片和麩炒山藥統(tǒng)片表面與截面拉曼光譜比較Fig.9 Comparison of Raman spectra obtained on surface and cross-section of common Chinese yam and Chinese yam stir-fried with bran

表3 山藥與麩炒山藥飲片478 cm-1處特征峰強(qiáng)度分析結(jié)果(n=6)Tab.3 Analysis results of characteristic peak intensity at 478 cm-1 for Chinese yam and Chinese yam stir-fried with bran(n=6)

3 討論

本研究對(duì)各產(chǎn)地的山藥拉曼光譜圖分別進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)換處理，很難區(qū)分不同產(chǎn)地山藥的差異。進(jìn)一步對(duì)1 500～400 cm-1指紋區(qū)間的峰進(jìn)行判別分析，可以直觀區(qū)分廣西山藥和其他3個(gè)產(chǎn)地(河南、河北、安徽)的山藥，可能是由于廣西和其他3個(gè)產(chǎn)地的地域相差較遠(yuǎn)，氣候、地質(zhì)特點(diǎn)不同。

山藥經(jīng)過(guò)麩炒后，在800～400、2 000～1 500 cm-1區(qū)域內(nèi)圖譜的背景強(qiáng)度顯著升高，這可能是因?yàn)樯剿幵邴滬熍谥七^(guò)程中，山藥中的氨基化合物(如氨基酸)和還原糖(如葡萄糖)在常溫或加熱時(shí)發(fā)生聚合/縮合反應(yīng)[14](美拉德反應(yīng))，生成類(lèi)黑精等褐色物質(zhì)，使麩炒山藥飲片表面顏色加深，干擾了拉曼光譜的測(cè)定。另一方面，478 cm-1處的拉曼峰常作為淀粉多糖特征峰，其峰強(qiáng)度反映了多糖的聚合程度，麩炒山藥表面478 cm-1處拉曼特征峰的降低，提示山藥在麩炒過(guò)程中，飲片表面的淀粉多糖發(fā)生了降解，且根據(jù)峰強(qiáng)度下降程度，初步得知麩炒表面淀粉降解約80%。478 cm-1處拉曼峰的強(qiáng)度變化，可作為山藥飲片麩炒過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，以期為麩炒炮制工藝提供動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。然而麩炒山藥飲片的截面卻沒(méi)有出現(xiàn)峰強(qiáng)度的降低，可見(jiàn)麩炒過(guò)程中淀粉的一系列反應(yīng)只存在于表面。

4 結(jié)論

本研究對(duì)山藥的拉曼光譜進(jìn)行方法學(xué)研究，建立了山藥拉曼指紋圖譜的分析方法，分別對(duì)8批山藥片特征圖譜進(jìn)行分析，拉曼譜中出現(xiàn)在478、866、941、1 460 cm-1處的強(qiáng)峰，可認(rèn)為是山藥片的特征峰。此外，發(fā)現(xiàn)山藥與可溶性淀粉的拉曼指紋圖譜基本一致，驗(yàn)證了山藥根莖部的主要成分是淀粉。關(guān)于山藥的拉曼光譜研究雖有文獻(xiàn)報(bào)道[15]，但對(duì)其炮制后物料性質(zhì)及主要成分變化的研究甚少。研究表明，山藥麩炒前后物料性質(zhì)存在顯著差異，這為兩者的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了依據(jù)。該方法不需要任何樣品前處理，具有速度快、無(wú)損及無(wú)污染等特點(diǎn),是綠色的分析方法，以期為山藥及麩炒山藥飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。