◎ 于金英，全奕潔，王 津，汪 冶

（麗水學(xué)院，浙江 麗水 323000）

蓮 房（Lotus Seed Pot，LSP），蓮（Nelumbium nuciferum）的成熟花托，是蓮子收獲過(guò)程同時(shí)產(chǎn)生的農(nóng)副產(chǎn)品，蓮房中含有大量的原花青素（procyanidins，PC）成分，原花青素大多具有明顯的抗氧化、抗衰老作用[1,2]。原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素單體及其聚合體形成的多酚化合物[3]，按聚合度大小進(jìn)行分類，一般將聚合度為2～4的稱為低聚體（Proamhocyanidins Oligomers），簡(jiǎn)稱OPC，將聚合度≥5的稱為高聚體（Proamhocyanidins Polymers），簡(jiǎn)稱PPC。原花青素抗氧化活性受聚合度的影響，蓮房原花青素低聚體（LSOPC）與高聚體（LSPPC）延緩衰老作用是否具有差異性尚未可知。秀麗隱形線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans），又稱秀麗線蟲，是一種無(wú)毒無(wú)害、可以獨(dú)立生存的線蟲。本研究利用DPPH?清除試驗(yàn)以及模式生物秀麗線蟲壽命試驗(yàn)對(duì)蓮原花青素（LSPC、LSOPC和LSPPC）延緩衰老作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。本研究為蓮副產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值的提升和蓮原花青素的功能開(kāi)發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

處州白蓮蓬購(gòu)買于浙江省麗水市蓮都區(qū)老竹鎮(zhèn)處州白蓮種植基地，剝除蓮子，將蓮蓬自然陰干。N2野生型秀麗線蟲（C.elegansN2）、大腸桿菌（Escherichia coli）OP50（E.coliOP50）從Caenorhabditis Genetics Center（University of Minnesota，CGC）購(gòu)買。

1.2 試劑

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。DPPH自由基（DPPH?）標(biāo)準(zhǔn)品（TCI試劑）、甲醇、乙醇等均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器

SMZ-168型體視顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、GI-54TW型高壓滅菌器（廈門致微儀器有限公司）、SHP-150型生化培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、TG16G型離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、Wellscan MK 3全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）。SG250H超聲波提取器、HX-5FD真空冷凍干燥設(shè)備。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品制備

（1）蓮房原花青素（LSPC）樣品制備。選用陰干的去除蓮子的干燥蓮房若干，用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)24目篩，稱取適量粉末，經(jīng)超聲波輔助提?。ㄒ掖俭w積為50%，料液比1∶20，提取3次，提取25 min），離心過(guò)濾得到提取液。提取液經(jīng)過(guò)薄層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收酒精后，進(jìn)行冷凍干燥處理制備蓮房原花青素樣品。

（2）低聚蓮原花青素（LSOPC）和高聚蓮原花青素（LSPPC）樣品制備。利用蓮房原花青素中低聚體和高聚體溶解性差異進(jìn)行分級(jí)分離研究。將上述制備的蓮房原花青素樣品溶于水[4]，采用等體積的乙酸乙酯萃取3次富集低聚蓮房原花青素，回收溶劑制備低聚蓮房原花青素（LSOPC）樣品。萃取后的水溶液經(jīng)冷凍干燥制備高聚蓮房原花青素（LSPPC）樣品。

1.4.2 DPPH?清除試驗(yàn)

（1）DPPH?標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱定DPPH?標(biāo)準(zhǔn)品7.5 mg，甲醇溶解定容至100 mL，配成質(zhì)量濃度為75 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，甲醇定容至10 mL，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）清除DPPH? IC50計(jì)算。精密稱定制備的待測(cè)樣品，甲醇溶解，配制成不同濃度的待測(cè)樣品溶液作為試驗(yàn)組，分別取1 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中，加入5 mL 75 μg·mL-1的DPPH?標(biāo)準(zhǔn)液，甲醇定容、搖勻，置暗處反應(yīng)30 min，以甲醇作為參比在517 mm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)DPPH?清除率。清除率I=（1-Ac/A0）×100%，其中Ac為樣品溶液吸光度，A0為甲醇參比溶液吸光度。對(duì)不同濃度樣品DPPH?清除率數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4.3 秀麗線蟲壽命試驗(yàn)

（1）樣品濃度配制。將樣品（LSPC、LSOPC和LSPPC）加入到經(jīng)過(guò)E.coli OP50滅活LB菌液中混均，配制成給藥濃度40 μg·mL-1，把混有樣品的LB滅活菌液涂布到線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基（NGM）培養(yǎng)板表面。

（2）秀麗線蟲的同期化與培養(yǎng)。使用NaClO溶液對(duì)成蟲進(jìn)行同期化，把新得到蟲卵涂到含有E.coli OP50的NGM培養(yǎng)皿中20 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。

（3）蓮原花青素對(duì)秀麗線蟲壽命的影響。將同期化的L1期N2型秀麗線蟲隱桿，轉(zhuǎn)移到含有LSPC、LSOPC和LSPPC的NGM培 養(yǎng) 板，以 不含原花青素樣品的NGM培養(yǎng)板上秀麗線蟲作為空白對(duì)照，每平板中加入30條同期化秀麗線蟲，每次壽命觀察試驗(yàn)有3組平行試驗(yàn)，每天觀察平板上秀麗線蟲生長(zhǎng)情況，記錄死亡秀麗線蟲數(shù)量，并將死亡秀麗線蟲挑出。每2 d更換新鮮培養(yǎng)基，直至所有秀麗線蟲死亡，計(jì)算秀麗線蟲平均壽命，并繪制生存曲線。

（4）抗氧化酶活力測(cè)定。將同期化的L1期N2型秀麗線蟲分別置于含有LSPC、LSOPC和LSPPC的NGM培養(yǎng)板，20 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，EP管收集，加入1 mL磷酸鹽緩沖液（pH值6.0）于3 000 r·min-1離心1 min，棄上清液。進(jìn)一步加入滅菌后的生理鹽水洗滌，離心棄上清液，重復(fù)3次。超聲破碎儀破碎，離心，收集上清液，然后依據(jù)超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad prism5.0繪制生存曲線圖和組間多重比較（Two-Way ANOVA），平均壽命采用SPSS 26統(tǒng)計(jì)軟件中Kalpan-meir存活曲線分析程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用χ—±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.4.2的方法，繪制出DPPH?的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.195 1x+0.011，式中：x為DPPH·的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；y為517 nm處吸光值，R2=0.999 7。

圖1 DPPH?標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 蓮房原花青素樣品清除DPPH·結(jié)果

由圖2可知，蓮房原花青素（LSPC）、蓮房低聚原花青素（LSOPC）、蓮房高聚原花青素（LSPPC）清除DPPH?作用有差異性，其中蓮房低聚原花青素（LSOPC）清除DPPH?作用較對(duì)照組VC強(qiáng)，蓮房原花青素（LSPC）和蓮房高聚原花青素（LSPPC）清除DPPH?作用較弱。通過(guò)比較三者的清除DPPH?作用IC50值（表1），進(jìn)一步說(shuō)明蓮房低聚原花青素（LSOPC）具有較強(qiáng)的清除DPPH?作用。

圖2 蓮房原花青素樣品對(duì)DPPH?清除作用圖

表1 蓮原花青素對(duì)DPPH?清除作用IC50表

2.3 蓮原花青素樣品對(duì)C.elegans N2壽命的影響

由圖2可知，蓮房原花青素（LSPC）、蓮房低聚原花青素（LSOPC）、蓮房高聚原花青素（LSPPC）延長(zhǎng)秀麗線蟲壽命作用有差異性。從表2結(jié)果可以得知，3種類型原花青素在40 μg·mL-1時(shí)具有比較明顯的延長(zhǎng)秀麗線蟲壽命作用，其中LSOPC對(duì)平均壽命的影響最顯著，相對(duì)于對(duì)照組延長(zhǎng)平均壽命作用提高了30.38%。

圖3 LSPC、LSOPC和LSPPC分別對(duì)C.elegans N2壽命的影響圖

表2 蓮原花青素對(duì)C.elegans N2壽命的影響表

2.4 蓮原花青素對(duì)C.elegans N2抗氧化活性酶（SOD和GSH-Px）的影響

由圖4可知，蓮房原花青素（LSPC）、蓮房低聚原花青素（LSOPC）、蓮房高聚原花青素（LSPPC）對(duì)秀麗線蟲抗氧化酶活性有不同影響，其中LSOPC顯著提升了抗氧化活性酶（SOD和GSH-Px）活性。

3 結(jié)論與討論

衰老是復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，是機(jī)體在退化時(shí)功能下降及生理功能紊亂的綜合表現(xiàn)。1956年HARMON提出了衰老的自由基學(xué)說(shuō)[5]。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為機(jī)體的衰老是由于自由基的過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生各種破壞而引起的，維持體內(nèi)適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┖妥杂苫宄齽┧?，可以延緩衰老和延長(zhǎng)壽命。在衰老和相關(guān)疾病研究領(lǐng)域，秀麗線蟲已經(jīng)成為研究衰老的理想模式生物[6]。秀麗線蟲是研究衰老作用的首選模式生物。因此本研究選擇DPPH?清除試驗(yàn)和秀麗線蟲壽命試驗(yàn)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。天然抗氧化劑具有清除自由基作用和延長(zhǎng)壽命作用，具有潛在的應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值。

本研究對(duì)3種不同類型蓮原花青素（LSPC，LSOPC和LSPPC）進(jìn)行延緩衰老作用評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示LSOPC在體外具有顯著的體外DPPH?清除作用，且能顯著延長(zhǎng)模式生物秀麗線蟲平均壽命，提示LSOPC具有較好的延緩衰老作用。LSOPC可開(kāi)發(fā)為功能因子來(lái)預(yù)防和改善衰老。

SOD和GSH-Px是有效清除生物體內(nèi)活性氧的重要保護(hù)酶類，通過(guò)催化細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，從而防止氧自由基的形成。因此，適當(dāng)增加生物體內(nèi)SOD和GSH-Px含量有助于抗氧化和延長(zhǎng)壽命。LSOPC延長(zhǎng)秀麗線蟲壽命作用可能與提高SOD及GSH-Px酶活力作用有關(guān)。