穆艷娥,王明江,鄧?yán)麗郏鲝?,王瑞?/p>
(山西省薯類脫毒中心,太原 030000)
近年來,馬鈴薯市場需求量逐漸擴(kuò)大,為確保市場流通的馬鈴薯質(zhì)量,必須完善馬鈴薯病毒病檢測體系,既是對消費(fèi)者負(fù)責(zé),又能擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)馬鈴薯種植規(guī)模,增加種植戶經(jīng)濟(jì)收入。
了解馬鈴薯病毒類型,以及各類病毒癥狀,并根據(jù)檢測結(jié)果分析馬鈴薯病毒病防控措施。
檢測于2020 年8 月12 日在山西省薯類脫毒中心六樓實(shí)驗(yàn)室檢測二室進(jìn)行。
準(zhǔn)備不同馬鈴薯品種的試管苗,包括晉薯16 號15 株、夏波蒂16 株、費(fèi)烏瑞它15 株、青薯9 號15株、1801-3品種15株、1912-2品種15株、ZXS6-2-7品種15株、XM1-1品種15株、XM1-2品種15株、XM1-6品種15株,存儲(chǔ)溫度為15~22℃,準(zhǔn)備進(jìn)行病毒X、Y、S、A、M、PLRV 檢測[1]。檢測試劑盒由北京信達(dá)誠勤科技有限公司提供,所需設(shè)備為移液槍、酶聯(lián)儀、洗板機(jī)、離心機(jī)、天平、恒溫箱等。
配制樣品提取緩沖液,之后采集樣品,并用天平稱取0.3~0.4 g 樣品。向采樣袋中加入1:10(g/mL)體積樣品,提取緩沖液。然后用燒杯隔袋研碎樣品,使樣品和樣品提取緩沖液充分混勻,最后將混合液倒入離心管中編號并離心待用。試劑、酶聯(lián)板在25℃恒溫條件中培養(yǎng),培養(yǎng)箱中回溫0.5 h。0.5 h 后取出酶聯(lián)板,根據(jù)樣品數(shù)拆分板條,每條4 個(gè)樣品,并給板條編號。
配置洗液,用洗板機(jī)洗3 次,每次約3 min。排空酶聯(lián)板,按編號依次加入樣品,每孔100μL;最后進(jìn)行病毒陰性對照、陽性對照。酶聯(lián)板置于4℃黑暗環(huán)境,孵育16 h。取出并排空酶聯(lián)板,用洗液洗板3 次,每次約3 min。配制酶標(biāo)特異性抗體溶液。排空酶聯(lián)板,用排槍加入酶標(biāo)特異性抗體,每孔100μL。將酶聯(lián)板置于37℃黑暗環(huán)境,孵育1 h。取出并排空酶聯(lián)板,用洗液洗板3 次,每次約3 min。
配制PNPP 溶液。排空酶聯(lián)板,用排槍加入PNPP,每孔100μL。將酶聯(lián)板置于黑暗環(huán)境下孵育60 min。避免光直射或強(qiáng)光,取出并酶聯(lián)板,用酶標(biāo)儀讀取病毒數(shù)據(jù)并記錄。
樣品檢測數(shù)據(jù)值大于等于陰性對照值的2 倍,判定為該病毒為陽性(用“+”表示),填制《病毒室內(nèi)檢測結(jié)果單》。
此類病毒癥狀病葉紋路呈波浪狀,輕型花葉。病毒傳染載體主要是攜帶病毒的種薯[2]。使用DAS-ELISA 檢測馬鈴薯X 病毒,將檢測結(jié)果與陰性結(jié)果比對,確定是否存在病毒。
檢測中準(zhǔn)備不同馬鈴薯品種的試管苗,因?yàn)椴煌贩N馬鈴薯的病毒感染存在差異,根據(jù)試管苗陰性、陽性呈現(xiàn)結(jié)果證明病毒存在與否。結(jié)果顯示,試管苗均為陰性,說明馬鈴薯無X 病毒。
Y 病毒傳播途徑主要是蚜蟲,要掌握蚜蟲早期活動(dòng)以及危害程度,了解Y(PVY)病毒的發(fā)病特征,為馬鈴薯Y(PVY)病毒的防控提供依據(jù)。Y 病毒是病毒病的代表,檢測工作要保證時(shí)效性和準(zhǔn)確性。
對試管苗進(jìn)行DAS-ELISA 檢測,同樣將檢測結(jié)果與陰性結(jié)果比較,據(jù)此得知是否存在Y 病毒。檢測發(fā)現(xiàn),試管苗均為陰性,馬鈴薯苗無Y 病毒。
此類病毒具有潛隱性,主要在馬鈴薯花、葉上寄生。由于馬鈴薯品種各異,所以S 病毒發(fā)生率有一定差異性,病癥表現(xiàn)也不盡相同??偨Y(jié)發(fā)現(xiàn),多數(shù)馬鈴薯種帶S 病毒后,癥狀表現(xiàn)為葉脈顏色加深,葉色顏色淡化,葉片縮小,葉尖卷起。當(dāng)蚜蟲出現(xiàn)在馬鈴薯田,或者蚜蟲與未感染病毒的馬鈴薯接觸時(shí),會(huì)間接傳播S 病毒。
檢測方式同X、Y 病毒檢測法,檢測結(jié)果表明,約1/5 試管苗攜帶S 病毒。因此,要有效防控S 病毒,否則會(huì)造成馬鈴薯減少,并且大幅降低馬鈴薯質(zhì)量。
基于馬鈴薯Y 病毒分離出A 病毒,此類病毒對馬鈴薯質(zhì)量、產(chǎn)量有重要影響。A 病毒癥狀表現(xiàn)為馬鈴薯葉變黃,并且葉片上出現(xiàn)斑點(diǎn),葉片光滑度逐漸下降。這類病毒傳播方式以蚜蟲接觸為主,以汁液接觸傳播為輔。
試管苗進(jìn)行DAS-ELISA 檢測,通過酶聯(lián)免疫檢測儀獲取光密度值,并對比試驗(yàn)結(jié)果與陰性結(jié)果,據(jù)此判斷試管苗是否攜帶A 病毒。檢測結(jié)果顯示,試驗(yàn)材料無A 病毒。
此類病毒又被稱為小葉病毒病,傳播方式與馬鈴薯A 病毒傳播方式相同。M 病毒會(huì)造成馬鈴薯植株心葉的葉柄長勢向上,復(fù)葉面積變小,并且葉面光滑度下降,呈非規(guī)則狀。
試驗(yàn)試管苗經(jīng)DAS-ELISA 檢測,得出光密度值,并對比試驗(yàn)結(jié)果,表明馬鈴薯M 病毒攜帶率為10%。病毒防控人員需做好準(zhǔn)備工作,避免M 病毒傳播擴(kuò)大。
卷葉病毒發(fā)病部位主要在馬鈴薯植株上部葉片,小葉底部易感染卷葉病毒。一般來說,病毒感染初期無明顯癥狀,感染末期發(fā)現(xiàn)葉片顏色改變,并且塊莖薯肉組織壞死。
使用DAS-ELISA 檢測法得知試管苗光密度值,檢測結(jié)果顯示,試管苗帶卷葉病毒概率為10%,說明馬鈴薯托脫毒處理工作刻不容緩。
根據(jù)檢測結(jié)果分析可知,馬鈴薯攜帶病毒的類型為PVX、PVY、PVS、PVA、PVM、PLRV。
PVX 病毒載體為種薯,需嚴(yán)格按照質(zhì)控要求培育薯種,大大降低PVX 病毒發(fā)生率。優(yōu)選馬鈴薯種,以環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、品質(zhì)高、抗病性強(qiáng)為基本選種標(biāo)準(zhǔn),可以從源頭控制病毒病。目前,各地區(qū)建立無菌種薯繁育基地,滿足無病毒種薯大量采購需求;同時(shí),研發(fā)脫毒技術(shù),為脫毒種薯培育提供技術(shù)支持。需注意的是,種田地區(qū)應(yīng)具備氣溫低、緯度高、風(fēng)速快等特征,這是培育脫毒種薯、無菌種薯的基本條件。當(dāng)脫毒種苗快速更新,意味著破壞了病毒病累積條件。此外,需堅(jiān)持科學(xué)化種植原則,種植在砂壤土上,且地塊灌溉便利、排水良好[3]。選定種植地之后需精細(xì)整地,適當(dāng)施加農(nóng)家肥,滿足馬鈴薯生長初期的養(yǎng)分需求。
Y(PVY)病毒檢測、S(PVS)病毒檢測結(jié)果顯示,蚜蟲是病毒傳播載體,可通過調(diào)整種植密度來防治蚜蟲,降低PVY、PVS 等病毒發(fā)生率。一般來說,適宜的種植密度為每公頃9.8 萬株,采用大行距、小株距播種方式。此外,播種時(shí)適當(dāng)投放防蚜顆粒劑,切斷蚜蟲攜帶病毒病的途徑。初期發(fā)現(xiàn)蚜蟲后,每隔6~9 天噴施滅蚜蟲藥,可使用30%噻蟲嗪拌種觸殺、胃毒。
根據(jù)PLRV(卷葉病毒)檢測結(jié)果可知,馬鈴薯植株上部葉片是病毒顯現(xiàn)的主要部位,尤其是小葉底部,最易感染卷葉病毒,一旦發(fā)現(xiàn)中心病株應(yīng)及時(shí)拔除,并對中心病株50 m 范圍內(nèi)噴施內(nèi)吸性殺菌劑進(jìn)行控制,可選用68%精甲霜靈.代森錳鋅水分散粒劑(金雷)。確定馬鈴薯感染病毒病之后,根據(jù)發(fā)病嚴(yán)重程度相應(yīng)制定防治措施,避免病毒病擴(kuò)散。