祛風通絡配伍對高糖誘導人腎小管上皮細胞活力及炎癥反應的影響

蘇冠旬 李麗娜 趙進喜 陳宇 薛泰騎 魏金艷 王淑艷 王世東

糖尿病腎病(diabetic nephropathies，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，亦是導致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。本團隊長期從事中醫(yī)藥防治DN的研究，學術奠基人呂仁和教授提出DN“微型癥瘕”病機理論，強調(diào)益氣化瘀散結，防止“微型癥瘕”的形成是治療DN的關鍵[2-3]，并在研究中證實了益氣化瘀散結法可以明顯改善DN腎功能不全患者的臨床癥狀、腎功能及血脂紊亂[4]，降低終點事件的發(fā)生率[5]。本團隊在繼承呂仁和教授學術思想的基礎上，經(jīng)過多年臨床實踐及實驗研究，提出DN“腎絡伏風”病機理論和“從風論治”治療思路，認為在腎絡“微型癥瘕”形成過程中，風邪也發(fā)揮了重要作用[6-7]，DN的治療在益氣的基礎上，除了化瘀散結，還應注重祛風通絡法的應用，臨床上使用益氣祛風通絡方(黃芪、鬼箭羽、牛蒡子、穿山龍、蠶砂)治療DN取得了一定的療效。既往研究發(fā)現(xiàn)，益氣祛風通絡方中祛風通絡配伍(牛蒡子、蠶砂、穿山龍)在治療DN方面具有一定的降低蛋白尿、延緩腎纖維化的作用，其機制與抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶/核轉錄因子-κB(phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine protein kinase/transcriptional nuclear factor-κB-1,PI3K/AKT /NF-κB)信號通路，下調(diào)轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)等炎癥因子的表達水平有關[8-9]。為進一步從分子生物學角度揭示祛風通絡配伍治療DN的機制，以及“從風論治”法的合理性，本實驗對祛風通絡配伍改善高糖誘導人腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cell,HKC)炎癥反應的分子機制進行了研究。

1 材料與方法

1.1 動物及細胞株

SPF級Wistar雄性大鼠20只，體質(zhì)量290～300 g，許可證號：SCXK(京)2016-0002，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物實驗室，實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審核并批準，審批號：BUCM-4-2021060901-2049。HKC購自北京協(xié)和細胞資源中心。

1.2 實驗藥物

祛風通絡配伍顆粒劑,組成：牛蒡子15 g、穿山龍30 g、蠶砂9 g，購置于北京康仁堂藥業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑及儀器

低糖DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司，批號：SH30022.01B)；高糖DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司，批號：AD20616263)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號:2045677RP)；SB203580(上海陶素公司，批號:152121-47-6)；CCK-8試劑盒(上海同仁化學研究所，批號:NV547)；白細胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白細胞介素6(interleukin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)ELisa試劑盒(美國Invitrogen公司，批號:88-7261、88-7066、88-7346)；細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1) antibody(Proteintech公司，批號:10020-1-AP)，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase, p38 MAPK) antibody(美國CST公司，批號:3690)，MCP-1 antibody、β-actin antibody、HRP標記羊抗鼠、羊抗兔IgG(Abcam公司，批號:ab9669、ab6276、ab6789、ab6721)；Total RNA Extraction Kit、mRNA cDNA Synthesis Kit、mRNA/lncRNA qPCR Kit(北京GenePool公司，批號:GPQ1801、GPQ1803、GPQ1808)。

雙垂直電泳槽(CAVOY，型號：MP-8001)；轉移槽(CAVOY，型號：MP-3030)；溫控搖床(其林貝爾，型號：TS-2000A)；電泳儀(CAVOY，型號：PP-1150)；熒光定量PCR儀(Bioer Technology，型號：Line Gene 9600 Plus)；分光光度儀(Thermo scientific，型號：NANODROP 2000)。

1.4 藥物血清制備

將20只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白組和祛風通絡組，每組10只。祛風通絡組每日給予祛風通絡配伍47.2 g/kg灌胃，正常組灌服同體積生理鹽水，上、下午各1次，連續(xù)灌胃3天。末次灌胃后2小時，麻醉后在大鼠股動脈無菌采血。將采集到的血液4℃下靜置4小時，3 000 r/min離心20分鐘，分離血清，56℃水浴中滅活30分鐘，過濾除菌，-20℃保存。

1.5 細胞培養(yǎng)及分組

從液氮中取出HKC，迅速復蘇，接種于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中，存放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，以后每1～2天完全更換培養(yǎng)液1次，待細胞長滿后用0.25%胰酶消化，進行細胞傳代，均勻傳入細胞瓶。

當細胞鋪滿瓶底80%～90%時，換無血清培養(yǎng)基同步化24小時，之后對細胞進行分組處理。正常組：89%DMEM低糖培養(yǎng)基+10%大鼠正常血清+1%雙抗；模型組：89%DMEM高糖培養(yǎng)基+10%大鼠正常血清+1%雙抗；抑制劑組：89%DMEM高糖培養(yǎng)基+10%大鼠正常血清+1%雙抗+5 μmol/L SB203580預處理；祛風通絡組：89%DMEM高糖培養(yǎng)基+10%祛風通絡配伍藥物血清+1%雙抗。繼續(xù)培養(yǎng)不同時間用于后續(xù)實驗。

1.6 檢測指標

1.6.1 細胞活力值 將重懸的HKC以5×104個/mL接種于96孔板并進行分組，每組6個復孔。細胞貼壁并生長狀態(tài)良好后進行干預給藥，分別于24小時、48小時后進行CCK-8檢測。按照說明書，每孔均加入100 μL的含10 μL CCK-8的培養(yǎng)基，37℃孵育2小時，在酶標儀450 nm波長下進行OD值檢測，并比較各組光密度(optical density,OD)值。

1.6.2 IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平 培養(yǎng)48小時后收集各組細胞上清液后離心，取上清液采用Elisa試劑盒檢測 IL-1β、 IL-6、TNF-α的含量，比較各組細胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平，每個指標均設3個重復。具體操作依照Elisa試劑盒說明書進行。

1.6.3 IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK的mRNA表達水平 培養(yǎng)48小時后收集各組細胞，提取組織樣本RNA進行電泳，以檢測RNA的完整性。用mRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒進行反轉錄，冰上操作并依次按照說明加入各組試劑，42℃孵育50分鐘，85℃孵育5分鐘，反應結束后短暫離心，得到的cDNA放置-20℃保存。引物由北京基譜生物科技有限公司提供，引物序列及長度見表1。將反應體系進行95℃ 30秒，95℃ 5秒，60℃ 30秒×45個循環(huán)，分別測定待測樣本目的基因及內(nèi)參的Ct值，計算并比較各組細胞IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、MCP-1、 p38 MAPK的mRNA表達水平，每個指標均設3個重復。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.6.4 ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK的蛋白表達水平 培養(yǎng)48小時后收集各組細胞，加入蛋白裂解液，提取細胞總蛋白。按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，一抗、二抗孵育，然后進行顯色、拍照。重復3次。結果采用Quantity One v.4.6.2軟件分析相對灰度值，統(tǒng)計并比較各組細胞ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK蛋白的表達水平，每個指標均設3個重復。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同時間點各組HKC的細胞活力比較

與正常組相比，模型組OD值顯著降低，提示細胞活力顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，高糖培養(yǎng)48小時后，抑制劑組細胞活力顯著提高(P<0.05)，高糖培養(yǎng)24小時、48小時后祛風通絡組細胞活力顯著提高(P<0.05)。結果見表2。

表2 不同時間點各組HKC的OD值比較

2.2 祛風通絡配伍對IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平的影響

與正常組相比，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組與祛風通絡組IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明顯減少(P<0.05)。結果見表3。

表3 祛風通絡配伍對各組HKC的IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平的影響

2.3 祛風通絡配伍對IL-1β、IL-6、TNF-α、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1的mRNA表達的影響

與正常組相比，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK的mRNA表達明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組與祛風通絡組各指標mRNA表達均明顯降低(P<0.05)。結果見表4～5。

表4 祛風通絡配伍對各組HKC的IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達的影響

表5 祛風通絡配伍對各組HKC的p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 mRNA表達的影響

2.4 祛風通絡配伍對p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1蛋白的表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，抑制劑組與祛風通絡組p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。結果見圖1、表6。

注：A 正常組；B 模型組；C 抑制劑組；D 祛風通絡組。

表6 祛風通絡配伍對各組HKC的p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1蛋白表達的影響

3 討論

中醫(yī)學認為糖尿病腎病當屬于《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“消癉”的范疇[10]，《靈樞·五變》：“余聞百疾之始期也，必生于風雨寒暑，循毫毛而入腠理，或復還，或留止，或為風腫汗出，或為消癉”，明確指出“消癉”發(fā)病與風邪相關。風為百病之長，其善行而數(shù)變的特性與糖尿病并發(fā)癥多、病情進展快的特點相類似。一方面，外感風寒、風熱或風濕等邪氣可加重糖尿病腎病的病情；另一方面，風邪入里可伏于腎絡，與痰、濕、瘀、郁相膠結，使得病情愈加復雜、纏綿難愈。觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病常見皮膚瘙癢、疼痛走竄、頭暈目眩、腿腳抽筋等“風毒”和“內(nèi)風”的表現(xiàn)[11]。故糖尿病腎病的治療尚需重視祛風通絡法的運用。

一些研究表明，“風藥”具有一定的抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[12-14]。本研究中使用的祛風通絡配伍包含牛蒡子、穿山龍、蠶砂，牛蒡子疏風清熱以散外風，穿山龍祛風除濕、通絡止痛，蠶砂為祛風除濕之要藥，三者相須為用，共奏祛風通絡之功。現(xiàn)代藥理學研究表明，牛蒡子主要成分為牛蒡子苷和牛蒡子苷元等具有降壓、降血脂、抗炎等作用[15-16]。研究表明，牛蒡子提取物可以減輕大鼠腎組織TGF-β1、MCP-1 mRNA的表達[17]，同時可以減少血清肌酐、血尿素氮及24小時尿蛋白，對腎臟具有一定的保護作用[18-19]。穿山龍可以降低血清TNF-α、抑制TNF-α mRNA的表達，并且可通過抑制IL-1β的分泌影響其下游的PI3K、CXCR4、JAK-STAT、NF-κB信號通路進而減輕炎癥反應[20-22]。蠶砂也有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，研究發(fā)現(xiàn)蠶砂提取物能調(diào)節(jié)細胞因子代謝、改善免疫功能，特別是促進CD4+回升和CD4+/CD8+的比值恢復[23]。因此，本實驗中的祛風通絡配伍對糖尿病腎病的治療有著充分的中醫(yī)學理論依據(jù)和藥理學研究基礎。

既往研究認為，在DN的發(fā)生進展過程中，最重要的病理生理變化是腎小球發(fā)生不可逆的纖維化，而腎小管損傷只是繼發(fā)現(xiàn)象。近期研究表明，腎小管損傷與DN的嚴重程度密切相關，且腎小管病變可不依賴于腎小球的改變[24]。在糖尿病的發(fā)生進展中，若腎小管持續(xù)處于高糖環(huán)境中就會誘導腎小管上皮細胞凋亡，進而出現(xiàn)腎小管萎縮、變性、進一步發(fā)展成腎小管間質(zhì)纖維化，導致不可逆的終末期腎功能衰竭[25]。本研究結果表明，高糖能明顯誘導腎小管上皮細胞損傷，表現(xiàn)為細胞存活率的降低，在SB203580預處理及祛風通絡配伍含藥血清干預后，腎小管上皮細胞的存活率明顯提高，說明高糖環(huán)境成功誘導了腎小管上皮細胞的凋亡，并且祛風通絡配伍可以提高細胞活力，對腎小管上皮細胞具有一定的保護作用。

p38 MAPK是MAPKs家族中4個主要信號轉導途徑之一，與腎臟炎性損傷過程中的細胞內(nèi)信號轉導關系密切[26-27]。p38 MAPK作為該通路的關鍵分子進入細胞核，調(diào)控部分轉錄因子的表達，促進MCP-1、TGF-β1和TNF-α、IL-6等相關炎癥細胞因子的產(chǎn)生，而其產(chǎn)生的MCP-1與其相應受體結合后可上調(diào)某些黏附分子如ICAM-1、VCAM-1的表達，促進炎性細胞如單核、巨噬細胞向炎癥反應部位聚集，從而增加組織細胞的炎性浸潤。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖能明顯誘導腎小管上皮細胞炎性反應，表現(xiàn)在細胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α升高，細胞中ICAM-1和MCP-1蛋白的表達顯著增高。祛風通絡配伍含藥血清干預后，能明顯減少IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌以及ICAM-1、MCP-1蛋白的表達，并抑制p38 MAPK的表達，說明祛風通絡配伍能減輕炎癥反應，從而延緩糖尿病腎病的進展。本研究結果只能說明祛風通絡配伍發(fā)揮抑制高糖誘導腎小管上皮細胞炎性反應的作用可能與p38 MAPK信號通路有關，而該通路是否為直接作用靶點以及是否存在其他與之關聯(lián)的機制，尚需在后續(xù)研究中進一步探索。

綜上，祛風通絡配伍可能通過p38 MAPK信號通路抑制高糖誘導HKC的凋亡，提高細胞活力，減輕炎癥反應。該研究結果可為“從風論治”糖尿病腎病的機制提供一定的依據(jù)。