水陸地黃膠囊通過LKB1/AMPK/Sirt1信號(hào)通路調(diào)控糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞自噬的實(shí)驗(yàn)研究

王惠玲 雷迪 趙思陽(yáng) 司海龍

自噬是真核細(xì)胞在相關(guān)蛋白和基因調(diào)控下，通過溶酶體系統(tǒng)清除細(xì)胞中的非正常細(xì)胞器，是重要的細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制[1]。當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激，如營(yíng)養(yǎng)變化、代謝壓力等改變時(shí)，自噬活性會(huì)極大提高[2]。正常情況下，細(xì)胞自噬有利于細(xì)胞保持自身穩(wěn)態(tài)，防止有毒或損傷蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的累積，維持著細(xì)胞健康生理功能。當(dāng)自噬被抑制時(shí)，細(xì)胞凋亡啟動(dòng)，可加速細(xì)胞死亡[3]。大量的研究證實(shí)腎臟足細(xì)胞自噬的異常與糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)[4]。Podocyte即腎小球臟層上皮細(xì)胞(glomerular epithelial cells，GEC)，是維持腎小球?yàn)V過屏障主要的細(xì)胞之一[5-6]。足細(xì)胞是高分化細(xì)胞，在人體中很難再分化，一旦損傷則不能再生，因此足細(xì)胞受損是DKD發(fā)病及進(jìn)展的標(biāo)志之一[7]。

近年來DKD發(fā)病率迅猛增長(zhǎng)，成為終末期腎病(end stagerenal disease，ESRD)的最常見病因[8]。目前，DKD的治療包括健康的生活方式、降糖藥物、RAS抑制劑、免疫抑制劑使用等，上述治療措施在DKD的某些階段確可發(fā)揮部分作用，但其副作用不容忽視，且隨病程推進(jìn)依然不能阻止DKD進(jìn)一步發(fā)展。中醫(yī)藥治療DKD可延緩病情進(jìn)展，療效顯著。水陸地黃膠囊以清代醫(yī)家程國(guó)彭《醫(yī)學(xué)心悟》的六味地黃湯為基礎(chǔ)，陜西省名中醫(yī)馬居里教授將其加減化裁為生黃芪、熟地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、丹皮、丹參、芡實(shí)和金櫻子十味藥物，并命名為水陸地黃膠囊(該膠囊由六味地黃湯及水陸二仙丹組成，前期命名為糖腎一號(hào)膠囊，現(xiàn)改名為水陸地黃膠囊，較前期命名體現(xiàn)其藥物組成)，該藥具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀之功效，臨床上用于DKD的治療并取得良好的療效。前期研究發(fā)現(xiàn)，水陸地黃膠囊能有效降低DKD患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)-9、MMP-2水平，提高基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-I(tissue inhibitor of metalloproteinase-I, TIMP-I)水平，減輕尿微量白蛋白，緩解臨床癥狀，延緩腎臟纖維化[9]。本課題在前期研究基礎(chǔ)上，觀察水陸地黃膠囊是否可通過激活肝激酶B1/腺苷酸活化的蛋白激酶/沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(LKB1/AMPK/Sirt1)信號(hào)通路調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬活性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SD大鼠，雄性，體質(zhì)量約200 g，SPF級(jí)，由三峽大學(xué)提供，許可證號(hào)為SCXK(鄂) 2016-0057。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫25℃，濕度70%,正常飲食。

1.2 藥品及試劑

水陸地黃膠囊，藥物組成：生黃芪30 g、熟地黃12 g、山藥15 g、山萸肉12 g、茯苓15 g、澤瀉15 g、丹皮12 g、丹參20 g、金櫻子15 g、芡實(shí)15 g，每粒 0.5 g(含生藥量13.4 g)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供；貝那普利(諾汀新)10 mg，批號(hào)：X3112，北京諾華制藥有限公司。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，批號(hào)：S110910,阿拉??；尿蛋白定量測(cè)試盒，批號(hào)：C035-2，南京建成；蘇木素，批號(hào)：H9627，Sigma；伊紅Y(水溶性)，批號(hào)：71014544，國(guó)藥集團(tuán)；包埋石蠟，批號(hào)：69019361，國(guó)藥集團(tuán)；中性樹膠，批號(hào)：10004160，國(guó)藥集團(tuán)；麗春紅S，批號(hào)：71033942，國(guó)藥集團(tuán)；酸性品紅，批號(hào)：F8129，Sigma；磷鉬酸，批號(hào)：20029916，國(guó)藥集團(tuán)；兔單抗LC3(14、16KD)，批號(hào)：83506，CST；兔多抗Bcl-2相互作用蛋白(Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1,Beclin-1)(60 KD)，批號(hào)：11306-1-AP,武漢三鷹；兔多抗沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(silent information regulator-1,Sirt1)(82KD)，批號(hào)：DF6033,Affinity；兔多抗肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)(65KD)，批號(hào)：AF6453,Affinity；兔多抗腺苷酶激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)(62KD)，批號(hào)：10929-1-AP,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司; 兔多抗P-AMPK(ser485)(62KD)，批號(hào)：4184,CST；兔多抗LC3(16/14KD)，批號(hào)：AF5402,Affinity。

1.3 儀器

FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀，Molecular Devices；病理切片機(jī)，德國(guó)Leica， RM 2016；脫水機(jī)，武漢俊杰，JT-12J；電腦生物組織脫水機(jī)切片刀，日本羽毛，R35；組織攤烤片機(jī)，武漢俊杰，JK-6；載玻片及蓋玻片，江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；顯微鏡，奧林巴斯，BX53；透射電鏡，日本HITACHI/美國(guó)FEI公司，HT7700-SS/FEI Tecnai G20 TWIN；電泳儀電源，北京六一儀器廠，DYY-7C；水平搖床，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，TS-1；pH計(jì)，德國(guó)Metter-Toledo GmbH公司；LP115電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，CPA；磁力攪拌器，江蘇省金壇市中大儀器廠，T8-1。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組

60只SD雄性大鼠隨機(jī)選取10只作為正常組(空白對(duì)照組)，對(duì)照組大鼠進(jìn)食普通飼料，造模組50只大鼠給予高脂高糖飼料，4周后，造模組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(40 mg/kg)，3天后禁食12小時(shí)取尾靜脈血，測(cè)空腹血糖≥6.7 mmol/L，確定為DKD大鼠造模成功[10]。其中，46只大鼠造模成功，4只血糖低于6.7 mmol，無(wú)死亡大鼠。將造模成功的DKD大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組(貝那普利組)、中藥組(水陸地黃膠囊組)，各10只。正常組與模型組大鼠每日予以生理鹽水3 mL灌胃，貝那普利組予以3 mL藥液灌胃(0.85 mg·kg-1·d-1研磨溶于3 mL生理鹽水)，水陸地黃膠囊組予以3 mL藥液灌胃(6 g·kg-1·d-1研磨溶于3 mL生理鹽水)，每天一次，固定時(shí)間，共計(jì)灌胃8周。灌胃結(jié)束留取腹主動(dòng)脈血標(biāo)本及24小時(shí)尿液標(biāo)本，處死大鼠留取腎臟。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.5.1 DKD大鼠相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 取腹主動(dòng)脈血標(biāo)本及24小時(shí)尿液標(biāo)本，生化分析儀檢測(cè)空腹血糖、肌酐、尿素氮；嚴(yán)格按照尿蛋白定量測(cè)試盒說明書操作測(cè)定尿微量蛋白。

1.5.2 腎臟組織病理學(xué)觀察 腎臟組織于4%多聚甲醛中固定，蒸餾水沖洗后，修整組織置于包埋盒中，組織脫水，浸蠟，包埋，切片，烤片，切片脫蠟， HE染色、 Masson染色，封片，光鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變。

1.5.3 透射電鏡觀察自噬泡的形成 取出固定完成的標(biāo)本，0.1 M磷酸緩沖液漂洗3次，1%的鋨酸、0.1 M磷酸緩沖液固定2小時(shí)，脫水，滲透，包埋，切片，染色，封片，電鏡下觀察足細(xì)胞的自噬小體。

1.5.4 Western blot檢測(cè)腎臟組織Beclin-1、LC3-II/I、LKB1、AMPK、p-AMPK、Sirt1蛋白的表達(dá) 將剪碎的組織塊置于EP管中，加入去污劑裂解液裂解后勻漿，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性，制備電泳膠，電泳分離及一抗、二抗孵育，顯色曝光。掃描膠片，分析膠片灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DKD大鼠相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

2.1.1 血糖 與正常組相比，給藥8周后模型組、西藥組、中藥組的血糖進(jìn)一步升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組血糖下降，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，提示中藥有一定的降糖功效。見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖比較

2.1.2 血肌酐、尿素氮 與正常組相比，模型組、西藥組、中藥組的血肌酐和尿素氮明顯升高，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，提示造模成功；與模型組相比，西藥組、中藥組的血肌酐和尿素氮下降，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組血肌酐和尿素氮下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清BUN、Scr比較

2.1.3 24小時(shí)尿微量白蛋白 與正常組相比，模型組、西藥組、中藥組24小時(shí)尿微量白蛋白明顯升高，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，提示造模成功；與模型組相比，西藥組、中藥組的24小時(shí)尿微量白蛋白明顯下降(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組24小時(shí)尿蛋白下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量比較

2.2 DKD大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察

2.2.1 HE染色 正常組大鼠腎臟組織細(xì)胞排列規(guī)則有序，腎小球、腎間質(zhì)等形態(tài)結(jié)構(gòu)大致正常；模型組可見細(xì)胞排列不規(guī)則，腎小球萎縮，腎小管上皮細(xì)胞脫落，出現(xiàn)管型；西藥組、中藥組腎臟組織病變較模型組明顯減輕，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)系膜增生。見圖1。

注：A正常組；B模型組；C西藥組；D中藥組。

2.2.2 Masson染色 正常組大鼠腎臟組織細(xì)胞排列規(guī)則有序，腎小球、腎間質(zhì)等形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；模型組出現(xiàn)大量纖維化；西藥組、中藥組腎臟組織病變較模型組明顯減輕。見圖2。

注：A正常組；B模型組；C西藥組；D中藥組。

2.3 觀察DKD大鼠腎臟組織自噬泡的形成

正常組細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)正常，可見明顯自噬泡，模型組細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，自噬泡較少；與模型相比，中藥組、西藥組自噬泡增多，提示自噬增強(qiáng)。見圖3。

注：A正常組；B模型組；C西藥組；D中藥組。

2.4 Western blot 檢測(cè)腎臟組織Beclin-1、LC3II/I、LKB1、AMPK、p-AMPK、Sirt1蛋白的表達(dá)

與模型組相比，中藥組、西藥組腎臟組織中Beclin-1表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，提示自噬啟動(dòng)；與模型組相比，中藥組、西藥組腎臟組織中的LC3II/I表達(dá)升高(P<0.05)，提示細(xì)胞自噬增強(qiáng)。與模型組相比，中藥組、西藥組腎臟組織中AMPK表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，而LKB1、p-AMPK、Sirt1蛋白的表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，提示該信號(hào)通路被激活。見圖4，表4、5。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織Beclin-1、LC3II/I、LKB1、AMPK、p-AMPK、Sirt1蛋白的表達(dá)

表4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠Beclin-1、LC3II/I、LKB1蛋白表達(dá)比較

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠AMPK、p-AMPK、Sirt1蛋白表達(dá)比較

3 討論

自噬泡的形成是診斷自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)，借助于電子顯微鏡可以判定。目前醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為Beclin-1是自噬發(fā)生的啟動(dòng)蛋白；LC3定位于自噬泡與自噬泡膜表面，當(dāng)細(xì)胞未發(fā)生自噬時(shí)，LC3形成LC3-I，當(dāng)細(xì)胞自噬啟動(dòng)時(shí)，LC3-I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II，結(jié)合到自噬體膜表面，因此LC3-II與LC3-I的比值可以定量描述自噬程度。綜上，本實(shí)驗(yàn)所及的觀察指標(biāo)：自噬泡、Beclin-1、LC3-II/I可以客觀地衡量自噬地發(fā)生與強(qiáng)度。Sirt1是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白脫乙酰酶，分別通過細(xì)胞內(nèi)一磷酸腺苷(AMP)和 NAD+水平的增加而被激活，為 Sirtuins 家族成員之一。目前發(fā)現(xiàn)Sirt1介導(dǎo)自噬有兩種方式，一方面是Sirt1使ATG和LC3脫乙?；瑢?dǎo)致自噬激活[11]；另一方面通過Sirt1-轉(zhuǎn)錄因子Foxo自噬通路，提高h(yuǎn)Vps34、ATG12和促凋亡蛋白Bnip3的表達(dá)[12]，參與自噬的正向調(diào)控。LKB1/AMPK/Sirt1信號(hào)通路作為Sirt1中正向調(diào)節(jié)通路，該信號(hào)通路活性的降低導(dǎo)致足細(xì)胞自噬受到抑制，對(duì)DKD的發(fā)生發(fā)展起到重大的推進(jìn)作用。研究表明，足細(xì)胞特異性Sirt1缺失加重了糖尿病db/db小鼠的蛋白尿和足細(xì)胞損傷[13]；二甲雙胍可以激活Sirt1和AMPK，防止高血糖引起的Sirt1蛋白水平降低，改善葡萄糖攝入足細(xì)胞，降低腎小球?yàn)V過屏障通透性[14]。中醫(yī)藥領(lǐng)域也有類似的研究，如研究發(fā)現(xiàn)中藥益腎顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)LKB1/AMPK/Sirt1信號(hào)通路，減輕DKD大鼠腎臟病理改變[15]。上述的研究提示：一方面LKB1/AMPK/Sirt1信號(hào)通路在糖尿病腎病大鼠中起作用；另一方面LKB1/AMPK/Sirt1信號(hào)通路與自噬的發(fā)生也密切相關(guān)。本課題的特點(diǎn)在于將LKB1/AMPK/Sirt1信號(hào)通路與自噬現(xiàn)象結(jié)合起來研究，探討它們之間的聯(lián)系，結(jié)果也顯示水陸地黃膠囊可通過調(diào)節(jié)LKB1/AMPK/Sirt1信號(hào)通路，改善足細(xì)胞自噬和恢復(fù)腎小球?yàn)V過屏障功能。

馬居里教授在DKD“氣陰兩虛，瘀血痹阻”病機(jī)理論基礎(chǔ)上將水陸地黃膠囊長(zhǎng)期應(yīng)用到臨床上，作為院內(nèi)制劑用于治療DKD，療效顯著?？v觀此方，六味地黃湯滋補(bǔ)腎陰為基礎(chǔ)方，生黃芪益氣固表，丹參活血化瘀，二仙丹固攝腎氣。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰，活血化瘀之功效。本研究結(jié)果表明：經(jīng)過水陸地黃膠囊干預(yù)的中藥組血糖明顯下降，提示中藥有一定的降糖功效，這也可能是中藥干預(yù)DKD的基礎(chǔ)。在這基礎(chǔ)之上中藥能進(jìn)一步改善腎功能：表現(xiàn)在血肌酐和尿素氮下降，及尿蛋白的控制。HE染色、Masson 染色的結(jié)果顯示：水陸地黃膠囊對(duì)腎臟正常結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。電鏡下觀察自噬泡的形成結(jié)果提示自噬增強(qiáng)。Western blot 檢測(cè)腎臟組織Beclin-1、LC3II/I、LKB1、AMPK/AMPK、Sirt1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：水陸地黃膠囊通過LKB1/AMPK/Sirt1信號(hào)通路增強(qiáng)足細(xì)胞自噬活性。綜上所述，水陸地黃膠囊能降低糖尿病腎病大鼠血糖，改善肌酐、尿素氮，減少尿蛋白，其機(jī)制可能是通過激活LKB1/AMPK/Sirt1信號(hào)通路，進(jìn)而增強(qiáng)足細(xì)胞自噬活性。