低劑量雙酚A 對雌性大鼠心室肌細(xì)胞鈣火花的影響及其機制

顏素娟 程曉曙 李菊香 陳亞梅 東 敏 王宏聲

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬電力教學(xué)醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100073；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌 330006；3.辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院，美國俄亥俄州，辛辛那提 45267

1993 年Cheng 等[1]在心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，雷諾丁受體（ryanodine receptor，RyR）在舒張期處于關(guān)閉狀態(tài)，但此時依舊能檢測到少量Ca2+從肌漿網(wǎng)通過RyR 漏至胞漿內(nèi)，這一過程可被共聚焦顯微鏡捕捉到并呈現(xiàn)為火花狀，名為鈣火花。當(dāng)鈣火花頻率和/或峰值增加，舒張期胞漿內(nèi)游離Ca2+的濃度就能明顯提高，導(dǎo)致延遲后除極的發(fā)生[2]。在日常生活中，從醫(yī)療器械到食品包裝的內(nèi)里，特別是聚碳酸酯及環(huán)氧樹脂等材料的生產(chǎn)過程中，通常都會添加雙酚A（bisphenol A，BPA）[3]。且多項研究已經(jīng)證明BPA 對人體有著各方面的危害[4-8]，本研究以體外分離的雌性大鼠心室肌細(xì)胞為研究對象，觀察BPA 是否會影響心室肌細(xì)胞鈣火花，并針對其機制進(jìn)行探討。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

選用20 只10～16 周，體重200～250 g 的二級清潔健康雌性SD 大鼠（Harlan，Indianapolis，IN）作為實驗對象，采用玻璃瓶喂養(yǎng)（Innovive，San Diego，CA）。使用經(jīng)Millipore Rios 16 及ELIX UV/Progard 過濾后的無BPA 水，并喂食不含有影響大鼠體內(nèi)雌激素成分的Teklad 飼料2020（Harlen）。動物實驗過程嚴(yán)格遵照辛辛那提大學(xué)動物實驗管理小組的相關(guān)手冊進(jìn)行，處死方式采用美國獸醫(yī)協(xié)會專家小組推薦的安樂死。

1.2 主要儀器與試劑

BPA 購自TCI 公司（批號：Cl03105ES），M199 培養(yǎng)液購自Gibco 公司（批號：31100-035），Ⅱ型膠原酶及透明質(zhì)酸酶購自Worthington 公司。層粘連蛋白（批號：114956-81-9）及Fluo-4 AM 購自Invitrogen 公司。

1.3 實驗分組及處理

1.3.1 心室肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 大鼠麻醉后處死，離體心臟經(jīng)Langendorff 灌注系統(tǒng)加入Ⅱ型膠原酶及透明質(zhì)酸酶進(jìn)行灌注、酶解，然后收集心室肌細(xì)胞。將小蓋玻片先用層粘連蛋白覆蓋，再接種細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞置于37℃，5%CO2的孵箱內(nèi)生長24 h 后用于實驗。

1.3.2 實驗分組 心室肌細(xì)胞按實驗要求分成對照組和BPA 組（添加濃度為10-9mmol/L 的BPA），每組細(xì)胞至少來源于3 只大鼠，每只大鼠取8～10 個細(xì)胞。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 心室肌細(xì)胞鈣火花測量 經(jīng)Fluo-4 AM 處理后的心室肌細(xì)胞見圖1，置于共聚焦顯微鏡（ZEISS，LSM510）的記錄槽內(nèi)，利用線掃描（100 μm/s），分別記錄對照組及BPA 組的鈣火花，并用軟件IDL6.3 分析數(shù)據(jù)。

圖1 共聚焦顯微鏡下Fluo-4 AM 處理后的雌性成年大鼠心室肌細(xì)胞（40×）

1.4.2 心室肌細(xì)胞鈣瞬變測量 心室肌細(xì)胞用Fluo-4 AM 處理6 min 后置于槽內(nèi)。以0.5 Hz 的頻率刺激細(xì)胞，利用鈣離子成像系統(tǒng)記錄并保存心肌細(xì)胞的鈣瞬變數(shù)據(jù)，使用軟件clampfit9.2 分析數(shù)據(jù)。

1.4.3 心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷測量 將經(jīng)Fluo-4 AM處理后的心室肌細(xì)胞滴于記錄槽內(nèi)，對細(xì)胞進(jìn)行電刺激，待細(xì)胞鈣瞬變達(dá)穩(wěn)態(tài)后，關(guān)閉刺激器，迅速加入咖啡因，記錄心室肌細(xì)胞的Ca2+濃度變化至其回歸基線，用軟件clampfit 9.2 分析數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組鈣火花頻率及峰值比較

共聚焦顯微鏡下可見兩組均有明亮鈣火花出現(xiàn)，見圖2。BPA 組鈣火花頻率高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。兩組的鈣火花峰值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

圖2 兩組雌性大鼠心肌細(xì)胞鈣火花示意圖

表1 兩組鈣火花頻率及峰值比較（）

表1 兩組鈣火花頻率及峰值比較（）

注：BPA：雙酚A

2.2 兩組鈣瞬變峰值及tau 值比較

BPA 組鈣瞬變峰值高于對照組，鈣瞬變tau 值短于對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。見表2。

表2 兩組鈣瞬變峰值及tau 值比較（）

表2 兩組鈣瞬變峰值及tau 值比較（）

注：BPA：雙酚A

2.3 兩組穩(wěn)態(tài)下肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷及其tau 值和靜態(tài)下肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷比較

穩(wěn)態(tài)下BPA 組肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；兩組的肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷tau值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。靜態(tài)下，兩組肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 兩組穩(wěn)態(tài)下肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷及其tau 值和靜態(tài)下肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷比較（）

表3 兩組穩(wěn)態(tài)下肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷及其tau 值和靜態(tài)下肌漿網(wǎng)鈣負(fù)荷比較（）

注：BPA：雙酚A

3 討論

美國人群的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，95%以上的被調(diào)查者尿液中都能檢測到平均濃度為1.33 μg/L 的BPA[9]。Gaynor 等[10]也發(fā)現(xiàn)BPA 存在于手術(shù)器械中，先天性充血性心力衰竭的新生兒在完成胸外科手術(shù)后體內(nèi)的BPA 濃度明顯升高。目前已證實BPA 是雌激素的內(nèi)分泌干擾化合物，能通過受體機制模擬/拮抗雌激素的作用。多項研究發(fā)現(xiàn)BPA 能促進(jìn)兒童肥胖，誘發(fā)前列腺癌細(xì)胞增殖，影響人類生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能異常，造成神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，改變?nèi)祟愋袨榈龋@一系列不良作用主要是通過基因和受體非基因機制產(chǎn)生[7,11-12]。早在2008 年9 月就有研究報道BPA 與心血管疾病之間有著密切的關(guān)系，此后多項研究發(fā)現(xiàn)BPA 濃度與心律失常、心源性猝死、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛等疾病之間密切相關(guān)[13-16]。

胞漿內(nèi)Ca2+循環(huán)在心室肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用，本課題組既往實驗發(fā)現(xiàn)BPA 能增加雌性大鼠心肌細(xì)胞的收縮率，濃度為10-9mmol/L時作用最強，而雄性大鼠心肌細(xì)胞對BPA 無反應(yīng)[17]，推測其或許能影響心室肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+循環(huán)。鈣火花是舒張期自肌漿網(wǎng)內(nèi)經(jīng)RyR 流至胞漿的Ca2+漏[1]，是心律失常產(chǎn)生的最根本原因之一[2，18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)BPA能明顯增加成年雌性大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)的鈣火花頻率，而對鈣火花的峰值無影響。根據(jù)鈣火花的形成機制，推測本研究中鈣火花的一系列變化可能是通過增加肌漿網(wǎng)上的RyR 的開放率和/或增加肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣負(fù)荷來實現(xiàn)的。

有研究利用二維脂質(zhì)雙層模擬肌漿網(wǎng)觀察鈣火花的形成，結(jié)果顯示局部有多個RyR 通道參與鈣火花的形成[20]。也研究認(rèn)為鈣火花是局部6～20 個RyR通道同時漏出Ca2+所形成的[21]。RyR 具有3 種異構(gòu)體，心臟中主要存在RyR2，心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)上的RyR2通道異常與心律失常密切相關(guān)[22-23]。有研究發(fā)現(xiàn)，兒茶酚胺相關(guān)性多形性室速患者可以檢測出突變的RyR2基因，利用這一突變基因建立的小鼠模型可誘發(fā)出運動相關(guān)的心律失常和猝死。實際上目前已有50 余種RyR2 基因突變與遺傳性心源性猝死之間有關(guān)聯(lián)[24]。而通過穩(wěn)定RyR2 通道能減少心律失常的發(fā)生。最近一種新型藥物JTV519 能穩(wěn)定狗快速起搏導(dǎo)心衰模型心肌細(xì)胞中Calstabin 2 與RyR 的結(jié)合，從而減少肌漿網(wǎng)Ca2+漏[25-26]。本研究結(jié)果顯示，在BPA 的刺激下，心室肌細(xì)胞鈣火花頻率增加，肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣負(fù)荷不變。因此靜息狀態(tài)下BPA 可增加心室肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)上RyR的開放率，使舒張期肌漿網(wǎng)上的RyR 開放增多，影響鈣火花的頻率。

為了更好地模擬大鼠體內(nèi)的環(huán)境，本研究以0.5 Hz的頻率刺激心室肌細(xì)胞，待細(xì)胞收縮達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，再測定肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣負(fù)荷。此時結(jié)果顯示，在BPA 的作用下肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣負(fù)荷量明顯增加。本研究還檢測了心肌細(xì)胞的鈣瞬變，結(jié)果顯示BPA 能明顯升高鈣瞬變的峰值，并且明顯縮短鈣瞬變tau 值。心肌細(xì)胞收縮后，胞漿內(nèi)Ca2+的移除有兩種途徑，一種是通過肌漿網(wǎng)上的Ca2+-ATP 酶將Ca2+泵回肌漿網(wǎng)內(nèi)，另一種是通過細(xì)胞膜上的鈉鈣交換體將Ca2+泵出細(xì)胞外。咖啡因誘導(dǎo)的鈣瞬變時，其能使肌漿網(wǎng)上的RyR 全部開放，所以此時胞漿內(nèi)的Ca2+主要是通過鈉鈣交換體來移除的。而BPA 并不影響咖啡因誘導(dǎo)鈣瞬變的tau值，推測BPA 不影響鈉鈣交換體的功能。因此BPA可能通過影響Ca2+-ATP 酶，增加每次心肌細(xì)胞收縮后進(jìn)入肌漿網(wǎng)的Ca2+量，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度增加。

因此本研究推測BPA 可能通過增加鈣火花的頻率，誘發(fā)出延遲后除極，促使雌性大鼠室性心律失常的發(fā)生。但本研究僅僅從細(xì)胞水平進(jìn)行實驗，至于在離體心臟甚至在整體動物水平能否造成心律失常，則需進(jìn)一步的實驗來證實。

綜上，BPA 能通過每次心肌收縮逐漸增加心室肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣負(fù)荷，并提高RyR 的開放率，促進(jìn)心肌細(xì)胞舒張期肌漿網(wǎng)的Ca2+漏，增加鈣火花的發(fā)生頻率。