劉東升，劉婷婷，姚世霞，朱旭江*，張明童*，朱琳，蘇蕊

1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070；

2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局 中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070

風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片是由制馬錢子（調(diào)制粉）、麻黃、當(dāng)歸、續(xù)斷、桃仁、紅花等17 味中藥制成的中藥制劑，具有祛風(fēng)燥濕、活血止痛的功效，臨床上用于治療腰腿疼痛、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等證。處方中馬錢子為調(diào)制粉入藥，占處方總量的28%，其有效成分為馬錢子堿和士的寧，兩者都是毒性成分。其中，士的寧毒性較強(qiáng)，且治療劑量和中毒劑量接近[1]，士的寧對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性較大，成人口服5～10 mg 就會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀[2-6]。馬錢子堿用于毒殺嚙齒類動(dòng)物和其他害蟲(chóng)，可阻斷神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)，呈現(xiàn)箭毒性[6-8]。風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第三冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀和常規(guī)檢查項(xiàng)，缺少專屬性指標(biāo)成分的定性鑒別和定量測(cè)定方法，無(wú)法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)可控和質(zhì)量安全有效的目標(biāo)。

本研究結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片質(zhì)量評(píng)價(jià)方法[9-16]和《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版（一部）馬錢子、麻黃和當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的有關(guān)方法[17-19]，采用麻黃、當(dāng)歸對(duì)照藥材和馬錢子堿、士的寧對(duì)照品為指標(biāo)性成分，分別建立了相應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法；并分別采用馬錢子總生物堿對(duì)照提取物和馬錢子堿、士的寧對(duì)照品測(cè)定樣品含量，探討馬錢子總生物堿對(duì)照提取物代替馬錢子堿、士的寧對(duì)照品的可行性；完善了風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為提高其質(zhì)量控制方法提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)保證其質(zhì)量具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀（沃特世公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；ME204 型分析天平（梅特勒-托利多公司）；SAMPLER4 型薄層色譜點(diǎn)樣儀（卡瑪公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品鹽酸麻黃堿（批號(hào)：171241-201508，純度：99.8%）、馬錢子堿（批號(hào)：110706-200505，純度：97%）、士的寧（批號(hào)：110705-200306，純度：95.9%），馬錢子總生物堿對(duì)照提取物（批號(hào)：112030-201601，含 馬 錢 子 堿45.4%，士 的 寧49.9%）、麻黃對(duì)照藥材（批號(hào)：121051-201606）、當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)：120927-201516）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；試劑均為色譜純；水為超純水。

馬錢子（調(diào)制粉）、麻黃、當(dāng)歸、蒼術(shù)、續(xù)斷、桃仁、紅花、乳香（制）、沒(méi)藥（制）、千年健、地楓皮、羌活、地龍、桂枝、穿山甲（制）、木瓜、牛膝經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院中藏藥室馬瀟主任中藥師鑒定為正品，均符合《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）項(xiàng)下規(guī)定。

風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片為A（批號(hào)分別為20170201、20170202、20170203、20170301、20170401、0170402）、B（批號(hào)分別為20141101、20131102）、C（批號(hào)：20141001）和D（批號(hào)：20140101）4 家生產(chǎn)企業(yè)共10批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 麻黃的薄層色譜法（TLC）鑒別

取本品3 g，研細(xì)，分別加三氯甲烷20 mL，濃氨試液1 mL，振搖1 h，取離心后的上清液加鹽酸溶液（3→10）5 mL，振搖混勻，蒸干上層液，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取麻黃對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取鹽酸麻黃堿對(duì)照品，加三氯甲烷制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例及制備工藝，制備缺麻黃的陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。依據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版（四部）TLC[20]試驗(yàn)，分別吸取供試品及陰性樣品溶液各10 μL，其余各3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（40∶10∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以茚三酮試液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，均出現(xiàn)相同的特征斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 麻黃TLC圖

2.2 當(dāng)歸的TLC鑒別

取本品約2.4 g，研細(xì)，加乙醚40 mL，加熱回流1 h，揮干乙醚液，殘?jiān)右宜嵋阴? mL 使溶解，作為供試品溶液。取當(dāng)歸對(duì)照藥材1 g 和陰性樣品2.4 g（按處方比例及制備工藝，制備缺當(dāng)歸的陰性樣品）照供試品溶液的制備方法，同法分別制成對(duì)照藥材溶液和陰性樣品溶液。依據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版（四部）TLC[20]試驗(yàn)，分別吸取陰性和供試品溶液各10 μL，對(duì)照藥材溶液3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，均出現(xiàn)相同的特征斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 當(dāng)歸TLC圖

2.3 馬錢子含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為CAPCELL PAK C18MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉與0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀等量混合溶液（用磷酸調(diào)pH 2.8）（B），梯度洗脫（0～45 min，17%～20%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。在上述條件下，陰性樣品、對(duì)照、馬錢子總生物堿對(duì)照提取物及樣品的HPLC 圖見(jiàn)圖3。

圖3 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片專屬性HPLC圖

2.3.2 溶液的制備 對(duì)照提取物溶液：精密稱取馬錢子總生物堿對(duì)照提取物23.60 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻線，搖勻，即得。

對(duì)照品溶液：分別精密稱取馬錢子堿和士的寧對(duì)照品12.81、16.02 mg 于100 mL 的量瓶中，加甲醇至刻線，搖勻，即得。

供試品溶液：取本品15 片，除去包衣，研細(xì)，取粉末約2 g，精密稱定，置錐形瓶中，滴加5%氫氧化鈉溶液約8 mL，混勻，超聲處理（250 W，50 kHz）2 min。精密加入三氯甲烷25 mL，稱定質(zhì)量，置于70 ℃水浴加熱回流2 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失質(zhì)量，充分振搖，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液：按處方比例及制備工藝，制備缺馬錢子的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成不含馬錢子堿和士的寧的陰性樣品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 取馬錢子總生物堿對(duì)照提取物溶液（馬錢子堿質(zhì)量濃度為0.106 2 mg·mL-1，士的寧質(zhì)量濃度為0.117 8 mg·mL-1）和對(duì)照品溶液（馬錢子堿質(zhì)量濃度為0.098 86 mg·mL-1，士的寧質(zhì)量濃度為0.124 30 mg·mL-1），按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣0.5、3.0、5.0、8.0、10.0、15.0 μL。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積A 為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸分析。

對(duì)照提取物：馬錢子堿及士的寧回歸方程分別為Y=1 841 826.94X-40 431.31（r=0.999 9）；Y=1 995 338.32X-50 076.73（r=0.999 9），表明馬錢子堿和士的寧分別在0.005 310～0.159 300、0.005 890～0.176 650 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

對(duì)照品：馬錢子堿及士的寧回歸方程分別為Y=108 123.41X-291.24（r=0.999 9）；Y=139 697.79X-171.65（r=0.999 9），表明馬錢子堿和士的寧分別在0.004 913～0.147 410、0.006 215～0.186 450 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)：20170201）的供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣，結(jié)果馬錢子堿和士的寧峰面積的RSD 分別為0.53%、1.21%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)：20170201），在室溫下放置0、6、12、16、20、24 h后分別進(jìn)樣，測(cè)定待測(cè)成分峰面積積分值。結(jié)果馬錢子堿和士的寧峰面積的RSD 分別為1.26%、2.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批（批號(hào)：20170201）的供試品6 份，平行測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算馬錢子堿和士的寧含量的RSD 分別為2.12%、1.61%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密吸取2.3.2 項(xiàng)下對(duì)照提取物溶液和對(duì)照品溶液2 mL，各平行6 份，置12 個(gè)具塞錐形瓶中，氮?dú)獯蹈桑俜謩e精密稱取已知含量的同一批樣品（批號(hào)：20170201）約1 g，加入上述錐形瓶中，按供試品溶液的制備方法同法處理，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果馬錢子堿平均回收率分別為103.20%、101.90%，RSD 分別為2.56%、1.85%；士的寧平均回收率為95.65%、97.27%，RSD 分別為1.90%、1.72%（表1），表明測(cè)定方法的回收率良好。

表1 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿、士的寧含量測(cè)定的加樣回收率試驗(yàn)

2.4 樣品測(cè)定

按2.3.1 和2.3.2 項(xiàng)下方法測(cè)定10 批樣品中馬錢子堿和士的寧的含量，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，馬錢子總生物堿對(duì)照提取物和馬錢子堿對(duì)照品測(cè)得樣品中馬錢子堿含量分別為0.018 8～0.748 1、0.012 6～0.731 5 mg/片；馬錢子總生物堿對(duì)照提取物和士的寧對(duì)照品測(cè)得樣品中士的寧含量分別為0.034 9～0.813 1、0.038 9～0.795 9 mg/片。

表2 不同生產(chǎn)廠家風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿和士的寧的含量測(cè)定mg/片

3 討論

3.1 提取方法和時(shí)間考察

馬錢子含量測(cè)定中，分別考察超聲處理和加熱回流2 種提取方法。精密稱取樣品6 份各約2 g，置錐形瓶中，滴加5%氫氧化鈉溶液約4 mL，混勻，超聲處理2 min 后，精密加入三氯甲烷25 mL，稱定質(zhì)量后，分別超聲30、45、60 min或70 ℃水浴加熱回流1、2、3 h 后分別測(cè)定馬錢子堿和士的寧含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，釆用加熱回流提取效率更高、更完全，且70 ℃水浴加熱回流2 h 時(shí)已基本提取完全，所以采用70 ℃水浴加熱回流2 h的方法處理樣品。

3.2 色譜條件的確定

取士的寧和馬錢子堿對(duì)照品溶液，分別在190～400 nm 進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，士的寧在200.5、253.5 nm 均有吸收，馬錢子堿在195.8、264.2、299.8 nm 處均有紫外吸收。結(jié)合《中國(guó)藥典》2020年版（一部）馬錢子項(xiàng)下士的寧和馬錢子堿的測(cè)定方法，最后選定260 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。且在此檢測(cè)波長(zhǎng)下對(duì)照品和樣品都能得到較好的圖譜。參考《中國(guó)藥典》2020年版馬錢子品種及有關(guān)文獻(xiàn)[3,5,19]，考察以乙腈為流動(dòng)相A，以0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉與0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀等量混合溶液（用磷酸調(diào)pH 2.8）為流動(dòng)相B，進(jìn)行等度和梯度洗脫。對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用上述流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，得到較好的峰形和分離度。

3.3 限度規(guī)定

處方中馬錢子（調(diào)制粉）的量折算為55.9 mg/片，按此計(jì)算，士的寧應(yīng)折算為0.642 9 mg/片（其中規(guī)定馬錢子（調(diào)制粉）制法為取制馬錢子，粉碎成細(xì)粉，照《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）馬錢子〔含量測(cè)定〕項(xiàng)下的方法測(cè)定士的寧含量后，加適量淀粉，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.15%，混勻，即得）。《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）馬錢子藥材士的寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.20%～2.20%，并結(jié)合士的寧的不良反應(yīng)和日口服量（士的寧為馬錢子的主要毒性成分，口服致死量為30 mg），暫定0.30～0.50 mg/片。風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片口服量一次4 片，2 次/d。計(jì)算后1 d 口服馬錢子中士的寧最大量為4.0 mg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于口服致死量。參考《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）馬錢子和馬錢子粉項(xiàng)下含量，士的寧與馬錢子最低含量比約為1.5。結(jié)合10 批樣品中馬錢子堿含量測(cè)定結(jié)果。暫時(shí)規(guī)定馬錢子堿含量不低于0.30 mg/片。即本品每片含馬錢子以馬錢子堿（C23H26N2O4）計(jì)不得少于0.30 mg，以 士 的 寧（C21H22N2O2）計(jì) 應(yīng) 為0.30～0.50 mg。待收集多批樣品積累數(shù)據(jù)后再修訂合適的含量限度。

4 結(jié)論

風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀和常規(guī)檢查項(xiàng)，不能有效控制藥品質(zhì)量，本研究依據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版完善了風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）藥材項(xiàng)下相關(guān)方法并結(jié)合文獻(xiàn)[6-11]，建立了麻黃和當(dāng)歸的薄層方法，得到的薄層色譜圖斑點(diǎn)清晰，且陰性無(wú)干擾；參考《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）馬錢子藥材項(xiàng)下含量測(cè)定的方法及相關(guān)文獻(xiàn)[7-8,19]，建立了風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿和士的寧的HPLC 含量測(cè)定方法。上述方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片質(zhì)量控制提供參考。同時(shí)，本研究對(duì)采用馬錢子堿、士的寧對(duì)照品與馬錢子總生物堿對(duì)照提取物對(duì)測(cè)定風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿和士的寧的含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)SPSS 27 軟件，采用獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)），對(duì)分別選用對(duì)照品與對(duì)照提取物作為對(duì)照后測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中馬錢子堿和士的寧含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]到馬錢子堿和士的寧為嚴(yán)格管控的劇毒化學(xué)品，且單體對(duì)照的純度非常高，存在安全隱患，而馬錢子總生物堿對(duì)照提取物純度較低、安全性好、成本較低，更易獲得[4]。因此，馬錢子總生物堿對(duì)照提取物代替馬錢子堿、士的寧單體對(duì)照有較強(qiáng)的可行性。