徐長溪，楊曉鵬

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

牙周病是危害人類口腔健康的兩大疾病之一，它能破壞牙周支持組織，牙周附著喪失，導(dǎo)致牙齒松動脫落，目前牙周再生性手術(shù)包括引導(dǎo)組織再生術(shù)和植骨術(shù)[1]。單純的引導(dǎo)組織再生術(shù)利用膜性材料作為屏障，引導(dǎo)具有再生能力的牙周膜細(xì)胞優(yōu)先占據(jù)根面，從而形成牙周組織的再生，單純的植骨術(shù)通過采骨或骨的替代品等移植材料來促進(jìn)新骨形成，大多數(shù)骨移植材料只起到支架材料的作用，單純引導(dǎo)組織再生和單純植骨在促進(jìn)骨缺損再生修復(fù)，以及促進(jìn)牙周組織新附著的形成效果不佳[2- 3]。由于組織工程學(xué)概念的引入，牙周組織工程成為新的研究方向，組織工程成功的關(guān)鍵之一是支架材料，殼聚糖，膠原等膜生物材料屬于生物支架材料[4- 5]。殼聚糖(Chi)是甲殼類動物外骨骼中幾丁質(zhì)的脫乙酰衍生物。可誘導(dǎo)、刺激結(jié)締組織重建，具有抑菌性[6]。膠原膜具有微孔結(jié)構(gòu)，良好的組織相容性和柔韌性、無抗原性、可降解吸收，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可增加附著力，能促進(jìn)牙周組織的新生，但存在力學(xué)性能差，體內(nèi)降解速度快等缺點[7-8]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

殼聚糖：脫乙酰度85%，廈門星隆達(dá)試劑公司；Ⅰ型膠原(上海生工生物試劑公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。實驗儀器：LGJ-1C冷凍干燥機(上海醫(yī)用分析儀器廠)，JSM-7300EX型掃描電鏡(日本JEOL產(chǎn))，721分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，液壓力學(xué)測試儀(DCS-5000，SHIMADZU Co，Tokyo Japan)，81-2型恒溫磁力攪拌器，PM-6型倒置顯微鏡及附屬照相設(shè)備，健康的成年大耳兔6只，體重(2.0～2.5)kg，ICR小鼠雌雄各一半，共12 只，由錦州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 采用冷凍干燥法制備

配制2%的醋酸溶液，稱取一定質(zhì)量的殼聚糖粉末，將其完全溶解于稀醋酸溶液中，靜置一段時間脫氣泡，在殼聚糖的醋酸溶液中加入膠原，充分地攪拌，殼聚糖與膠原的質(zhì)量比分別是1∶1，1∶2和1∶3。加入2%的乙酸溶液至所需體積；再加少量的0.25%的戊二醛(GTA)，混合均勻后再將制備的混合物重新脫氣泡，然后注入到玻璃培養(yǎng)皿中，在冷藏柜中4 ℃交聯(lián)12 h后，再置于冷凍柜中-20 ℃，24 h冷凍成型[9]。將支架浸泡在氫氧化鈉堿液中，中和殘余乙酸數(shù)小時，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，之后冷凍干燥，形成殼聚糖-膠原復(fù)合支架，支架兩側(cè)紫外線照射30 min備用。

1.3物理性能的檢測

1.3.1 孔隙率的測定

液體置換法測定支架孔隙率。將不同比例制成的Chi-Col多孔支架切成適當(dāng)大小，分3組，每組3個樣本，分別置入體積為V1的無水乙醇中，待乙醇充分進(jìn)入多孔支架的孔隙中，至沒有氣泡逸出。此時，乙醇體積(浸沒支架)記錄為V2。輕輕將浸滿乙醇的支架樣品取出，剩余乙醇體積記為V3。計算材料的孔隙率，如下計算：ε=(V1-V3)/(V2-V3)，每組3個樣本，結(jié)果取其均值。

1.3.2 孔徑大小測定

分別將3種比例制成的Chi-Col支架材料表面噴金處理并進(jìn)行掃描電鏡觀察。不同比例每組3塊樣品，每塊樣品選取3個視野，每視野測量材料5個孔徑值。

1.3.3 力學(xué)測試

樣本制備成 0.5 cm×2.5 cm×0.03 cm 矩形，在液壓力學(xué)測試儀上測量其彈性模量和最大拉伸強度，拉伸應(yīng)變速率為 1 mm/ min，直到膜斷裂，按每種比例3個樣本測量，每種支架測量3次。

1.4 安全性檢測

以殼聚糖膠原質(zhì)量比為1∶2的比例制成的支架作為實驗組進(jìn)行安全性檢測。制備浸提液：將1 g Chi-Col支架材料切割成2 mm大小塊狀，紫外線消毒后置入50 mL生理鹽水中，37 ℃下浸提24 h。

1.4.1 急性全身毒性試驗

取ICR小鼠12只，雌雄各半，隨機平均分為2組，每組雌雄各一半。對實驗組小鼠腹腔注射支架材料浸提液1 mL；對照組注射與實驗組相同量的生理鹽水。分別于注射后12、24、48、72 h觀察小鼠一般情況及毒性表現(xiàn)，以及呼吸、步態(tài)、活動等不良反應(yīng)癥狀及有無死亡。

1.4.2 皮內(nèi)刺激試驗

新西蘭白兔3只，脊柱兩側(cè)背部剃毛，暴露皮膚酒精消毒，在兩側(cè)各選擇5個點，2點間隔2 cm。另一側(cè)在每個點注射與實驗側(cè)相同量的生理鹽水來作為對照側(cè)。在注射后的24、48、72 h分別觀察每一個注射部位及周邊組織有無充血、抑脹、積液、壞死等刺激反應(yīng)，并評價結(jié)果。

1.4.3 溶血試驗

將實驗共分為3組：浸提液為實驗組、蒸餾水為陽性對照組、生理鹽水為陽性對照組。每組3支試管，8毫升/支，37 ℃水浴30 min。采新鮮兔血4 mL，立即加至抗凝管中。加生理鹽水5 mL稀釋兔血，每根試管加0.2 mL稀釋后的兔血，搖勻，在37 ℃水浴箱中繼續(xù)保溫60 min，所有試管均離心2500 r/min離心5 min后取上清，肉眼觀察上清液顏色，顯微鏡觀察沉淀物涂片。用紫外分光光度計在545 nm波長測定上清液的吸光度(A)，計算溶血率。溶血率=(實驗組A-陰性組A)/(陽性組A-陰性組A)×100%，評判標(biāo)準(zhǔn):溶血率小于5%時，可判定該材料無溶血作用。超過5%表明材料有溶血作用。

1.4.4 熱原試驗

選用3只新西蘭白兔，先測定其正常體溫，于15 min內(nèi)，向兔耳緣靜脈按10 mL/kg劑量緩慢注入支架材料浸提液，液體溫度37 ℃，注射后每隔1 h測量體溫1次，共3次，3次中最高的體溫減去正常體溫的差值為該兔的體溫升高值。如果每只兔升溫小于0.6 ℃，3只實驗兔升溫總數(shù)小于1.4 ℃，即認(rèn)為支架材料浸提液無熱原反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

3種比例制得的Chi-Col支架，大小1.2 cm×1.2 cm×1.2 cm，為黃色海綿狀，有彈性，表面疏松多孔，可隨意修剪，用手觸摸感覺有彈性，柔軟，支架可以彎曲但不會開裂，說明支架具有較好的柔韌性，見圖1。

圖1 復(fù)合材料的大體形態(tài)

2.2 復(fù)合材料的孔隙率及孔徑

不同配比Chi、Col多孔復(fù)合膜孔隙率測量結(jié)果的統(tǒng)計分析與比較，各組間比較有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

2.3 不同比例Chi-Col支架材料的電鏡觀察

制備的Chi-Col支架掃描電鏡下計算孔隙率的大小都很接近，但不同比例復(fù)合的支架，孔徑的大小有所不同，各組之間差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同比例Chi-Col支架材料孔隙率，孔徑檢測結(jié)果

2.4 復(fù)合支架彈性模量和最大拉伸強度

當(dāng)Chi/ Col為12時，得到最大彈性模量和最大拉伸強度。A組、B組與C組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同比例Chi-Col支架材料彈性模量和最大拉伸強度檢測結(jié)果

2.5 急性全身毒性試驗

結(jié)果顯示，72 h后，實驗組和對照組動物狀態(tài)良好，呼吸平穩(wěn)，活動、食欲無異常，未見驚厥、癱瘓和死亡現(xiàn)象。實驗前后小鼠體重?zé)o明顯變化，與對照組無顯著性差異。

2.6 皮內(nèi)刺激實驗

皮下注射浸提液后，在3 d觀察期間內(nèi)，各實驗側(cè)注射點及其周邊組織均未見充血、水腫、積液、壞死等刺激反應(yīng)，皮內(nèi)刺激實驗陰性，與各對照側(cè)無明顯差異。

2.7 溶血試驗

材料對新鮮兔血的溶血度平均值為3.6%，小于5%，在允許的范圍之內(nèi)，見表3。

表3 溶血試驗測定結(jié)果(A值)

2.8 熱源試驗

實驗組體溫升高分別為0.31 ℃、0.27 ℃、0.20 ℃，均在0.6 ℃以下，3只新西蘭兔溫度升高總數(shù)為0.78 ℃，在1.0 ℃以下，滿足熱原檢測要求，表明該材料無致熱作用，見表4。

表4 注射浸提液后兔體溫的變化(℃)

3 討 論

3.1 支架制備

殼聚糖有良好的生物相容性，無免疫原性，體內(nèi)降解緩慢，被廣泛用于成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞、表皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等培養(yǎng)的細(xì)胞外支架，它在組織工程中具有很大的潛力，殼聚糖作為一種組織工程支架材料所具有的大量優(yōu)點雖然得到了研究者的肯定，但也有一些研究文獻(xiàn)指出細(xì)胞親和力不夠理想[10-11]。膠原具有生物相容性好、免疫原性低、體內(nèi)易降解、降解速度快等優(yōu)點[12]，價格低廉，易于獲得，在組織工程中應(yīng)用廣泛，但其強度并不理想。在本實驗中，殼聚糖和膠原蛋白結(jié)合形成多孔支架，用以彌補其單一材料用作組織工程材料的不足。在殼聚糖和膠原的復(fù)合過程中，殼聚糖帶有正電荷，通過靜電作用來與膠原蛋白分子結(jié)合，而膠原中含有大量的氨基和羧基親水基團，因而隨膠原的引入，增加了殼聚糖的親水性，從而也提高了溶質(zhì)的透氧性能。而殼聚糖提高了膠原網(wǎng)絡(luò)體系機械強度不足的缺點，可提高支架材料的機械強度和增加其降解時間[13-14]。

3.2 支架物理性能

通過掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)3組材料均有的孔徑，Chi-Col支架材料呈葉片狀，支架的孔和孔之間相互連通構(gòu)成通孔?？椎姆植己涂椎幕ミB性對于促進(jìn)細(xì)胞增殖和骨骼向內(nèi)生長起到關(guān)鍵作用[15]。支架的通孔是一種理想的結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的生長，有利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運輸和排出。整個支架內(nèi)分散著大量微孔，部分區(qū)域較為集中，形成支架的孔隙區(qū)域;還有部分區(qū)域形成了無孔的片狀區(qū)，說明該支架在一些局部孔比較均勻，但整體范圍內(nèi)均勻性要稍差一些。無孔片狀區(qū)可能是較厚的孔壁，也可能為孔上結(jié)膜形成閉孔所導(dǎo)致。用不同比例的殼聚糖和膠原制備的多孔支架的孔隙率如表1所示。在實際制備多孔支架時，應(yīng)考慮支架材料的降解速率，如果降解速度快，則初始孔隙率不應(yīng)過高[16]。在研究范圍內(nèi)，膠原比例越高，支架的吸水性能越好，因此支架的含水量也越高，基本上和材料成分比成線性關(guān)系，但是，各殼聚糖膠原支架間的含水量的差距并不大，波動在95%左右。這種現(xiàn)象可能是由于高膠原含量支架中殼聚糖與膠原親水基團相互作用的結(jié)果。從以上數(shù)據(jù)，我們可以證明殼聚糖—膠原復(fù)合支架具有非常好的保水性，這樣的支架可以防止體液和營養(yǎng)物質(zhì)的流失，對細(xì)胞生長和組織再生是很有利的。

3.3 支架生物安全性

良好的組織相容性是指存在于體內(nèi)不會發(fā)生全身或局部的毒性反應(yīng)、不會導(dǎo)致溶血、不會引起炎性和排斥反應(yīng)，有良好的免疫相容性，有利于骨組織迅速長入材料孔內(nèi)并與材料緊密結(jié)合，Chi和Col具有良好的生物降解性與生物相容性[17]。但是，復(fù)合過程中加入了戊二醛交聯(lián)劑，因此有必要對材料的安全性進(jìn)行測試[18]。評價生物材料相容性的方法較多，ISO公布的醫(yī)療器械生物學(xué)評價試驗指南(ISO-10993)中基本評價的生物學(xué)試驗包括細(xì)胞毒性、刺激性或皮內(nèi)反應(yīng)、全身急性毒性、植入性、血液相容性等。目前評價標(biāo)準(zhǔn)已達(dá)到細(xì)胞和分子水平[19]。Chi-Col支架的細(xì)胞相容性較好，本實驗選擇了幾種較為常見的生物學(xué)試驗方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)支架材料溶血率為3.6%，低于5%，故無溶血作用，與生物材料溶血試驗的要求相符。熱原試驗顯示3只實驗兔的體溫升高值分別為0.31、0.20、0.20 ℃均低于0.6 ℃，體溫升高數(shù)值之和低于1.4 ℃，無熱原反應(yīng)，是組織相容性好的生物材料。綜上所述，Chi-Col支架材料屬于安全的生物材料，具有良好生物相容性，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究Chi-Col支架材料提供了生物學(xué)依據(jù)。殼聚糖、膠原等天然聚合物因其良好的結(jié)構(gòu)和生化特性近年來在組織工程中被廣泛應(yīng)用[20]，因此，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究殼聚糖-膠原支架的生物學(xué)特性，如支架的制備方法、材料力學(xué)性能的改善等都是值得深入研究的問題。