徐焰平 王翠玲＊

（泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校檢驗(yàn)預(yù)防學(xué)院，福建 泉州 362010）

鐵皮石斛是一種藥用植物，化學(xué)成分經(jīng)藥理學(xué)研究具有提高免疫功能、抗腫瘤等作用[1]。內(nèi)生真菌生物類群豐富，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)于各種植物體內(nèi)普遍存在，藥用植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或類似藥用活性成分[2]。前期有多個(gè)研究者從藥用植物鐵皮石斛中分離內(nèi)生真菌，從中篩選出能夠產(chǎn)生抗菌、提高機(jī)體免疫力或抗腫瘤成分的內(nèi)生真菌[3]。從中尋找新活性先導(dǎo)化合物，拓寬和豐富新藥源發(fā)現(xiàn)的渠道，可通過規(guī)模化的發(fā)酵獲取較多量的產(chǎn)物，用于新藥研發(fā)[4]。本項(xiàng)目從泉州仿生栽培的鐵皮石斛中分離出內(nèi)生真菌，進(jìn)行抑菌活性研究，并對(duì)具有抑菌活性的內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定。

一、材料與儀器

1.材料

龍眼樹上仿生態(tài)栽培的鐵皮石斛來自泉美生物科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)菌株金色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌ATCC 25922和蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579由本實(shí)驗(yàn)室提供。

2.藥品和試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂、LB培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司、PBS緩沖液（pH值7.4）在本實(shí)驗(yàn)室配置。ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’和ITS5 5'-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3’由大連Takara公司合成。

3.儀器設(shè)備

生物安全柜、顯微鏡、培養(yǎng)箱、analytikjena EasyCycler PCR儀、analytikjena UVsolo toutch等。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.內(nèi)生真菌的分離

鐵皮石斛樣本采集到實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)該于24h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。從采集的樣品中選取新鮮健康的鐵皮石斛，先用自來水沖洗干凈，去除表面雜土顆粒后自然晾干備用。根部和莖部剪成1cm左右的小段，葉片剪成0.5×0.5cm大小置于小燒杯中。在生物安全柜中，用75%酒精浸泡60s，接著用無菌水浸洗3次，再用3%次氯酸鈉（有效氯）溶液浸泡4min，最后再用無菌水浸洗3次。濾干余液后用鑷子將樣本置于含鏈霉素（50～100mg/L）和青霉素（100～300mg/L）馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中，每直徑為9cm的培養(yǎng)皿放入6～8個(gè)組織塊。放入培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)5～10d，待樣本周圍長(zhǎng)成肉眼可見的菌落時(shí)，用接種鉤挑取菌落邊緣的菌絲體移入另一個(gè)平板上，繼續(xù)培養(yǎng)。將分離到的優(yōu)勢(shì)菌種利用平板劃線法進(jìn)一步行進(jìn)純化分離，連續(xù)富集培養(yǎng)3次。當(dāng)富集培養(yǎng)不再出現(xiàn)雜菌時(shí)，再一次用平板劃線法進(jìn)行最后一輪菌株分離純化，重復(fù)3次。肉眼觀察真菌的特征，選擇生長(zhǎng)優(yōu)良的菌株。將得到的優(yōu)勢(shì)菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面上，28℃培養(yǎng)3～5d，放在4℃冰箱保存?zhèn)溆肹5]。

2.抑菌活性篩選

將上述分離到的內(nèi)生真菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中，放置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)5d。用無菌打孔器打出直徑6mm的菌餅，放置于裝有50mL液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后制成內(nèi)生真菌發(fā)酵液。培養(yǎng)條件為：溫度28℃，轉(zhuǎn)速200rpm。利用杯碟法（瓊脂擴(kuò)散法）測(cè)定內(nèi)生真菌對(duì)金色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽包桿菌三種細(xì)菌的抑菌功能，分別吸取0.1mL三種待測(cè)細(xì)菌的菌液到LB平板表面，用無菌玻璃涂布棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5～10min。用滅菌鑷子將無菌牛津杯置于平板中預(yù)定位置，再用鑷子尖端輕輕按壓牛津杯上部使之與培養(yǎng)基表面緊貼。往牛津杯中加入100μL內(nèi)生真菌發(fā)酵液，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18～24h，測(cè)量抑菌圈直徑，并計(jì)算其平均值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三組[6]。

3.內(nèi)生真菌的鑒定

3.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察。挑取已分離純化具有抑菌活性的QZQM08的新生菌絲，接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)，觀察該菌的菌落形態(tài)，并記錄其菌落大小、正反面的顏色、邊緣菌絲形態(tài)及是否產(chǎn)生孢子和孢子的顏色等特征。并利用銅圈進(jìn)行小培養(yǎng)，觀察真菌的結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)發(fā)育過程。根據(jù)菌落培養(yǎng)特征和顯微鏡下菌絲和孢子的形態(tài)特對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定[7]。

3.2 菌株的分子鑒定。按2.2的方法進(jìn)行真菌菌種培養(yǎng)，用改進(jìn)的蛋白酶K和苯酚抽提法進(jìn)行基因組DNA的分離與純化。利用通用引物ITS4和ITS5進(jìn)行ITS區(qū)域的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：反應(yīng)體系25uL，ddH2O 16.75μL；10×PCR Buffer 2.5μL；dNTP 2.5μL；ITS4和ITS5各1μL， 模板DNA luL（20～50ng）；TaKaRa rTaq酶0.25μL。 在analytikjena EasyCycler PCR儀按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5min使模板變成單鏈，95℃變性30S，將反應(yīng)體系溫度下降至55℃退火30S，再升溫至72℃延伸1min，循環(huán)次數(shù)30次；最后在72℃延伸5min。用生工生物工程（上海）股份有限公司的3S柱式離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒，按說明書的要求進(jìn)行的擴(kuò)增產(chǎn)物的純化[8]。將上一步提取的DNA送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。完成測(cè)序后將所得核酸序列提交至NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，下載軟件MEGA version 5.0進(jìn)行NJ系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[9]。

三、結(jié)果與討論

1.仿生栽培鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離

經(jīng)表面消毒的鐵皮石斛組織塊在培養(yǎng)3～4d后，逐漸觀察到有菌絲從組織塊的切口處長(zhǎng)出。經(jīng)過分離，從泉州地區(qū)仿生栽培鐵皮石斛中分離到內(nèi)生真菌21株，從葉片中分離到10株（47.62%），從莖中分離到6株（28.57%），從根中分離到5株（23.81%）。

2.內(nèi)生真菌的抑菌活性

通過抑菌活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離到的內(nèi)生真菌有17個(gè)菌株的發(fā)酵液至少對(duì)一種以上的供試細(xì)菌有抑菌活性，其中內(nèi)生真菌QZQM08對(duì)三種供試細(xì)菌的抑菌活性最強(qiáng)（如表1所示）。

表1 內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抑菌活性

3.內(nèi)生真菌QZQM08的菌落形態(tài)特征和鑒定結(jié)果

將抑菌活性最強(qiáng)的內(nèi)生真菌QZQM08進(jìn)行大培養(yǎng)和小培養(yǎng)。在平板上該菌菌落顏色為綠色，屬于快速生長(zhǎng)真菌，呈放射狀生長(zhǎng)形成密集的氈狀，表面質(zhì)地疏松、干燥、不透明。通過小培養(yǎng)直接觀察該菌菌絲透明有隔，有豐富的分枝，分生孢子梗呈樹枝型。分生孢子呈圓形至橢圓形，單生或串生，初步判定為木霉屬真菌。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將所得核酸序列提交至NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，選取GenBank中與QZQM08的ITS序列同源性高的系列菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，與QZQM08相似性較高的序列主要分布在木霉屬。