辜淑君， 陳德暉△， 張抗抗， 麥凱琳， 顧瑩瑩， 古梓壕

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1兒科，2病理科，廣東廣州510120）

閉塞性細(xì)支氣管炎（bronchiolitis obliterans，BO）是一種由小氣道損傷后炎癥及纖維化病變引起的慢性氣流阻塞性疾?。?］。BO 的發(fā)生常與嚴(yán)重感染、急性肺損傷、異體移植術(shù)后、吸入有毒物質(zhì)和自身免疫性疾病等有關(guān)［2］。成人BO 多與器官移植后宿主免疫反應(yīng)有關(guān)，約50%肺移植術(shù)后患者可發(fā)生BO［3］，3年病死率高達(dá)65%。

“BO”是病理診斷，指氣道內(nèi)2 mm以下的小氣道細(xì)支氣管黏膜下或外周炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化致管腔狹窄，目前BO 的致病機(jī)制尚未明了，良好的動(dòng)物模型有助于闡明BO 的發(fā)病機(jī)制和探索新的治療方法。移植后BO 常見移植物抗宿主反應(yīng)引起細(xì)支氣管廣泛炎癥反應(yīng)甚至管腔閉塞的改變。因此，本文擬構(gòu)建幼齡大鼠異位氣管移植的動(dòng)物模型，以評估移植后幼齡大鼠細(xì)支氣管在不同時(shí)點(diǎn)的病理改變。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF 級 Wistar 大鼠 63 只和 SD 大鼠 21 只，雄性，約3 周齡左右，體重在60～70 g 左右，均為南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。本研究所有動(dòng)物的處理及實(shí)驗(yàn)操作均通過廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理與使用倫理委員會(huì)審批。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 術(shù)前2 組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1 周適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分成2 組并做好標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)幼齡大鼠主要分為異型移植（SW，n=42）組和同型移植（WW，n=42）組。

SW 組：SD 大鼠為供體（n=21），Wistar 大鼠為受體（n=21），供體和受體隨機(jī)配對后進(jìn)行異位氣管移植，將供體氣管移植到受體頸背部皮下，分別在移植后第7、14 和28 天不同時(shí)段收取移植氣管，每個(gè)時(shí)段收取7只受體大鼠的樣本。

WW 組：供體（n=21）和受體（n=21）均為Wistar大鼠，供受體隨機(jī)配對后進(jìn)行異位氣管移植，將供體氣管移植到受體頸背部皮下，分別在移植后第7、14和28 天不同時(shí)段收取移植氣管，每個(gè)時(shí)段收取7 只受體大鼠的樣本。

2.2 供體氣管的獲取 兩組供體大鼠使用2%戊巴比妥納（40 mg/kg）［4］腹腔注射麻醉后仰臥位在手術(shù)臺(tái)上固定，頸胸部備皮。外科無菌操作下行頸胸部正中切口切開皮膚，鈍性分離頸部纖維及肌肉組織，充分暴露氣管，解剖游離氣管旁纖維組織、神經(jīng)、血管及食管，用外科縫合線分別在左、右主支氣管叉處及環(huán)狀軟骨處與氣管上段結(jié)合處結(jié)扎并離斷整根氣管，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗數(shù)次后放入含無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，并放入冰盒中備用。

2.3 供體氣管植入受體 予受體Wistar 大鼠2%戊巴比妥納（40 mg/kg）［4］腹腔注射麻醉成功后以俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，頸背部備皮。無菌操作下于頸背部正中處剪一長約2 cm小口，充分游離皮下組織，使其形成一個(gè)小囊腔［5］，用沾有生理鹽水的濕棉球清潔囊腔中滲出的血液，將移植氣管植入，并以外科縫合線逐層縫合囊腔周圍組織使氣管固定于囊腔中。外科縫合線縫合切口皮膚，再次消毒皮膚切口。

2.4 術(shù)后管理 術(shù)后將受體大鼠單獨(dú)置于清潔級鼠房內(nèi)觀察，全部大鼠30 min 內(nèi)清醒，肌力逐漸恢復(fù)，刺激疼痛有反應(yīng)。

術(shù)后大鼠正常飼養(yǎng)，每日每只大鼠大腿肌肉注射青霉素20萬U，連續(xù)3 d，使用碘伏消毒切口連續(xù)1周。每日觀察并記錄受體大鼠的切口生長狀況、活動(dòng)狀況、體重、飲食、精神變化、毛發(fā)、排泄情況及對外界刺激反應(yīng)等。

2.5 樣本采集 分別于移植后第7、14 和28 天對2組受體大鼠在無菌操作下進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)步驟采集標(biāo)本：（1）收取受體大鼠移植氣管：2組受體大鼠麻醉成功后，無菌操作下切開受體大鼠頸背部皮膚，取出移植氣管，氣管放入10%中性甲醛中固定待病理檢查；（2）受體大鼠肺組織的獲?。撼浞謱⒎闻c周圍組織分離，充分暴露后，結(jié)扎左主支氣管，右肺行肺泡灌洗，收取肺泡灌洗液后結(jié)扎右主支氣管并切取左右肺葉，存于10%中性甲醛溶液中，并標(biāo)記。

2.6 組織學(xué)分析 將甲醛固定好的供體氣管及受體肺組織進(jìn)行石蠟常規(guī)包埋，制成4 μm 的切片，進(jìn)行HE 及免疫組化染色。組織切片描述與分析：HE和免疫組化染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察移植氣管及受體大鼠肺小氣道的上皮細(xì)胞完整程度，纖維化程度、管腔閉塞程度及炎癥細(xì)胞浸潤程度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用統(tǒng)計(jì)軟件Prism 5（Graphpad）行統(tǒng)計(jì)學(xué)做圖及分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物的一般情況

所有大鼠至標(biāo)本采集階段存活情況良好，無死亡。從供體氣管獲取至氣管異位移植完畢平均用時(shí)（18±5）min。異型移植（SW）組與同型移植（WW）組受體大鼠術(shù)后無死亡，切口無感染。取少量動(dòng)物連續(xù)觀察SW 組與WW 組受體大鼠術(shù)前和術(shù)后7 d的體重增長均無差異（P＞0.05），全體動(dòng)物體重變化的定量分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

2 受體大鼠樣本的病理學(xué)觀察

2.1 受體大鼠樣本的HE 染色結(jié)果 WW 組移植氣管的病理學(xué)觀察：移植后第7 天時(shí)見移植氣管上皮細(xì)胞完整，可見輕微炎癥細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生不明顯（圖1A）；第14天見移植氣管炎部分癥細(xì)胞浸潤，伴有部分纖維結(jié)締組織增生（圖1B）；第28 天見移植氣管炎癥細(xì)胞浸潤增多，伴有部分纖維結(jié)締組織增生（圖1C）。SW 組移植氣管病理結(jié)果：移植后第7 天時(shí)見移植氣管部分上皮細(xì)胞丟失，黏膜下層可見少量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)部分纖維結(jié)締組織增生（圖1D）；第14天見移植氣管上皮細(xì)胞丟失，可見黏膜下層有大量炎癥細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生使管腔大部分閉塞，氣管壁周圍纖維結(jié)締組織增多（圖1E）；第28 天見移植氣管上皮細(xì)胞嚴(yán)重丟失，黏膜下層可見慢性炎癥細(xì)胞浸潤，增生的纖維結(jié)締組織使管腔完全閉塞，管壁周圍纖維組織增生明顯（圖1F）。

表1 SW組與WW組受體大鼠移植術(shù)前及術(shù)后體重變化Table 1. Comparison of the body weight between the recipient rats of SW group and WW group（g. Mean±SD. n=21）

Figure 1. Histopathological changes of the transplanted trachea on the 7th（A and D），14th（B and E）and 28th（C and F）days after transplantation in SW group and WW group（HE staining，×400）.圖1 SW組和WW組移植后7、14 和28 d移植氣管組織的病理學(xué)變化

WW 組受體肺組織的病理學(xué)觀察：氣管移植后第7 天時(shí)肺組織病理學(xué)改變不明顯，氣管上皮細(xì)胞完整，氣管壁無增厚，炎癥細(xì)胞浸潤不明顯，肺泡無明顯破壞（圖2A）；第14天時(shí)肺組織細(xì)支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤不明顯，上皮細(xì)胞少量脫落，氣管壁增厚不明顯，氣管周圍小血管壁增厚不明顯，肺泡無明顯破壞（圖2B）；第28 天肺組織細(xì)支氣管上皮細(xì)胞少量脫落，氣管周圍炎癥細(xì)胞部分浸潤，氣管壁輕度增厚，肺泡壁周圍有少量炎癥細(xì)胞浸潤（圖2C）。SW組受體肺組織病理結(jié)果：供體氣管移植后第7 天，受體肺組織組織病理學(xué)改變輕微，氣道上皮細(xì)胞較完整，管壁增厚不明顯，僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤，氣管周圍小血管壁輕度改變，肺泡周圍少量炎癥細(xì)胞浸潤（圖2D）；第14天肺組織細(xì)支氣管上皮細(xì)胞部分脫落，黏膜褶皺增多，氣管壁輕度增厚，肺泡周圍少量炎癥細(xì)胞浸潤伴肺泡破壞增多，氣管周圍小血管壁增厚（圖2E）；第28 天肺組織細(xì)支氣管炎癥細(xì)胞浸潤增多，纖維化明顯，伴有小血管管壁增厚，肺泡壁周圍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤（圖2F）。

Figure 2. Pathological changes of lung tissue of recipient rats on the 7th（A and D），14th（B and E），and 28th（C and F）days after transplantation in SW group and WW group（HE staining，×200）.圖2 SW組和WW組移植后7、14和28 d受體大鼠肺組織的病理學(xué)變化

2.2 免疫組化染色觀察 （1）α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）：WW 組移植后7、14和28 d 的免疫組化染色顯示氣道管壁連續(xù)性較完整，肌纖維破壞不明顯；SW 組在移植后7、14 和28 d免疫組化染色顯示氣道平滑肌連續(xù)性較差，肌纖維破壞明顯，平滑肌層斷裂明顯（圖3A）；（2）波型蛋白（vimentin）：WW 組在移植后 7、14 和 28 d 的 vimentin免疫組化染色陽性較弱，氣道管壁及周圍纖維化不明顯；SW 組在移植后 7、14 和 28 d 的 vimentin 免疫組化染色陽性較WW 組明顯，且可看到SW 組小氣道管壁周圍纖維化較明顯，還伴有炎癥細(xì)胞增多（圖3B）；（3）E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-Cad）：WW組氣道管壁在移植后7、14 和28 d 較完整，上皮細(xì)胞少量脫落；SW 組上皮細(xì)胞脫落程度在移植后7、14 和28 d 較WW組嚴(yán)重（圖3C）。

討 論

BO 是一種以細(xì)支氣管炎性彌漫損傷為主所致的慢性氣流受限綜合征，病理主要表現(xiàn)為細(xì)支氣管的部分或完全閉塞，臨床表現(xiàn)為持續(xù)咳嗽、喘息和呼吸困難。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，BO 發(fā)生發(fā)展的常見誘發(fā)因素多為嚴(yán)重感染、急性肺損傷或異體移植術(shù)后、吸入有毒物質(zhì)和自身免疫性疾病等［2］，引起B(yǎng)O 的病因較多，其中感染后BO 在兒童BO 最為常見。閉塞性細(xì)支氣管炎患兒喘息、低氧血癥和啰音可持續(xù)數(shù)月至數(shù)年，最后發(fā)展為復(fù)發(fā)性肺炎、復(fù)發(fā)性或慢性肺不張、肺心病、胸部畸形和杵狀指等［6］。當(dāng)感染后BO患兒存在嚴(yán)重的氣流阻塞、肺功能持續(xù)降低、嚴(yán)重依賴氧療的終末階段BO 患兒可考慮進(jìn)行肺移植［7］。成人多為移植后BO，與移植后移植物抗宿主反應(yīng)相關(guān)。有文獻(xiàn)顯示肺移植后的閉塞性細(xì)支氣管炎綜合征（bronchiolitis obliterans syndrome，BOS）進(jìn)行肺再移植可提高患者存活率［8］。

隨著器官移植技術(shù)的發(fā)展，BO 作為異基因造血干細(xì)胞移植（hematopoletic stem cell transplantation，HSCT）和肺移植等器官移植后并發(fā)癥的發(fā)生率越來越高，這促使人們?nèi)ド钊胙芯緽O 的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn)。因此，構(gòu)建一個(gè)合格的BO 動(dòng)物模型有助于模擬臨床致病過程，并對進(jìn)一步探討其潛在病理生理機(jī)制和開發(fā)新的BO 防治措施是非常有意義的。目前BO 存在多種動(dòng)物模型，包括嚙齒類動(dòng)物和大型動(dòng)物的原位肺移植、原位氣管移植和氣管皮下、體表、腹腔［9］和肺內(nèi)等不同部位的異位移植。本研究成功建立一種幼齡SD 大鼠和Wistar 大鼠的氣管異位移植致閉塞性細(xì)支氣管炎的動(dòng)物模型。結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組SW 組的病理表現(xiàn)有氣道部分上皮細(xì)胞丟失、纖維結(jié)締組織增生、氣管炎癥細(xì)胞浸潤增多及氣道官腔部分閉塞或完全閉塞等的改變，與Lewis 及B-N 大鼠異位氣管移植模型報(bào)道基本相似［5］，成功地模擬了臨床BO 炎癥細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織增生直到管腔閉塞的發(fā)展過程與病理學(xué)形態(tài)表現(xiàn)。由HE 染色可以看到，SW 組在移植后 7、14 和 28 d 移植氣管上皮細(xì)胞丟失、炎癥細(xì)胞浸潤、纖維組織增生以及管腔閉塞程度都比WW 組嚴(yán)重。免疫組化染色也顯示，SW 組樣本氣道平滑肌斷裂程度、管周纖維化程度及氣道上皮細(xì)胞脫落程度比WW 組更嚴(yán)重?？紤]是SW 組氣管異位移植產(chǎn)生排斥反應(yīng)更為強(qiáng)烈，產(chǎn)生大量炎癥因子釋放致組織損傷和異常修復(fù)。E-cad 是一類存在與于所有上皮組織中的跨膜糖蛋白，是調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附反應(yīng)的的主要介質(zhì)，對調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附和維持細(xì)胞形態(tài)具有重要作用［10］，其表達(dá)減弱甚至消失時(shí)，細(xì)胞間的黏附能力降低，從而更易出現(xiàn)細(xì)胞脫落或轉(zhuǎn)移。

Figure 3. Immunohistochemical observation on the expression of α-SMA（A），vimentin（B），and E-Cad（C）in the lung tissues of recipients on the 7th，14th and 28th days after transplantation in SW and WW groups（×200）.圖3 SW組和WW組移植后7、14和28 d受體肺組織α-SMA、vimentin和E-cad表達(dá)變化的免疫組化觀察

本研究使用3～4 周幼齡SPF 級SD 大鼠和Wistar大鼠進(jìn)行頸背部異位氣管移植構(gòu)建BO 動(dòng)物模型模擬兒童期BO 病程病理發(fā)展變化，實(shí)驗(yàn)簡單，相對肺或氣管原位移植大鼠模型操作更容易，可重復(fù)性強(qiáng)，術(shù)后管理容易，可較好地避免了手術(shù)感染風(fēng)險(xiǎn)及減少了模型大鼠死亡風(fēng)險(xiǎn)。異位氣管移植基本模擬了臨床BO 病理組織損害，可應(yīng)用于移植后BO 機(jī)制研究［11］。對比氣管異位移植腹腔大網(wǎng)膜所致移植后BO模型［9］，頸背部環(huán)境可以排除腹腔體液的干擾，且更接近于生理氣管頸部微環(huán)境。但不足之處是相對于原位氣管移植，氣管異位移植由于氣管周圍環(huán)境完全封閉，氣管腔沒有空氣流通的環(huán)境。此外，兒童BO 主要在小氣道發(fā)生病變，而異位氣管移植模型采用的是大氣道主氣管進(jìn)行造模，在反映小氣道發(fā)生病變可能較原位肺移植后BO 模型的病理改變較輕。但與其他BO 移植模型相比，在病理改變與實(shí)驗(yàn)可行性上頸背部異位氣管移植構(gòu)建BO 模型有很大優(yōu)勢，對今后兒童BO 致病機(jī)制的研究可提供重要的數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，本研究所構(gòu)建的幼齡大鼠異位氣管移植動(dòng)物模型的氣管病理改變可以誘發(fā)造模大鼠細(xì)支氣管氣道上皮細(xì)胞的脫落、纖維結(jié)締組織增多及淋巴細(xì)胞的浸潤和氣道管腔閉塞等改變，與Genden等［12］所構(gòu)建的BO動(dòng)物模型病理改變相似，為成功構(gòu)建的幼齡大鼠異位氣管移植BO 動(dòng)物模型，可為后續(xù)研究移植后BO機(jī)制與干預(yù)提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。