丁倚晴，李樹(shù)鵬，練家樂(lè)，劉夢(mèng)杰，劉 舉，李子良，雍 燕，劉 翠，郭世寧*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東省獸用中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，廣州 510642；2.恩平基龍實(shí)業(yè)有限公司，廣東江門(mén) 529400；3.廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東云浮 527400)

黃連解毒顆粒處方源于《中華人民共和國(guó)獸藥典》中的黃連解毒散(由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味中藥組成)，被視為清熱解毒的代表方，主治三焦熱盛之證[1]。臨床可用于治療豬的高熱綜合征、仔豬黃白痢、非典型新城疫和大腸桿菌混感等[2]。

黃連解毒散由大苦大寒的黃連等組成，其適口性很差，在臨床應(yīng)用時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致豬等味覺(jué)敏感動(dòng)物采食下降，用藥劑量難以得到準(zhǔn)確控制，影響疾病的防控效果。此外，中藥散劑僅是將藥材粉碎成細(xì)粉，但有效成分仍存留在細(xì)胞壁中，其在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用時(shí)，有效成分的溶出程度和速度亦將影響藥效[3]。散劑采用拌料給藥，消耗更多人力物力，不如飲水給藥方便快捷、成本低。綜合上述因素，將黃連解毒散經(jīng)過(guò)提取后制成水溶性的黃連解毒顆粒，將解決目前黃連解毒散的不足，提升藥效且便于臨床使用[4-5]。

本試驗(yàn)按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《畜禽用藥物靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[6]要求測(cè)定了黃連解毒顆粒對(duì)靶動(dòng)物雞的安全性，旨在為今后黃連解毒顆粒新藥申報(bào)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 黃連解毒顆粒由廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司動(dòng)物保健品廠生產(chǎn)。規(guī)格：每1 g相當(dāng)于原藥材1 g，每袋100 g，生產(chǎn)批號(hào): 20190101。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡黃羽肉雛雞100只(31.12±0.75 g)：飼養(yǎng)于廣東江門(mén)恩平基龍實(shí)業(yè)有限公司，試驗(yàn)期間嚴(yán)格按照管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.3 儀器設(shè)備 AUX-120電子天平為日本島津產(chǎn)品。BS-380全自動(dòng)生化分析儀為深圳邁瑞公司產(chǎn)品。微量移液器為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。ST16R高速冷凍型離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Thermo公司。CX31RTSF型生物顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。TP020型組織脫水機(jī)，RM2235型石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)均為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品。

1.4 主要試劑 蘇木素染色液、伊紅染色液、中性樹(shù)膠均購(gòu)自Solarbio公司。其他如PBS緩沖液、福爾馬林溶液為自行配制。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素(UREA)試劑盒均購(gòu)于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.5 動(dòng)物分組與處理 適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，根據(jù)《獸用中藥、天然藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》中對(duì)靶動(dòng)物安全試驗(yàn)的分組要求，選取健康活潑的雛雞 80 只，隨機(jī)分為四組，每組 20 只。根據(jù)該藥物劑量篩選試驗(yàn)推薦的臨床給藥劑量，設(shè)置黃連解毒顆粒推薦劑量的1倍劑量組(3 g/L)、3倍劑量組(9 g/L)、5倍劑量組(15 g/L)。3個(gè)用藥組持續(xù)飲水給藥7 d；對(duì)照組飲水中不添加任何藥物。

2 觀察和測(cè)定指標(biāo)

2.1 臨床觀察、血常規(guī)和血液生化指標(biāo)測(cè)定 每日觀察各組試驗(yàn)雞只精神狀態(tài)、采食情況、行為表現(xiàn)、糞便、呼吸情況，對(duì)異常情況進(jìn)行記錄。分別于給藥前和停藥后第7天，逐只稱重，同時(shí)記錄飼料消耗量。于給藥前、給藥第7天及停藥后第7天，每組隨機(jī)選取8只雞經(jīng)翅下靜脈采血，測(cè)定血常規(guī)及血生化指標(biāo)。

采用人工血球計(jì)數(shù)法及比色法進(jìn)行血常規(guī)的檢測(cè)：白細(xì)胞數(shù)目(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)目(RBC)、血紅蛋白數(shù)目(HGB)。血液生化指標(biāo)的檢測(cè)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素(UREA)。

2.2 剖解變化、病理組織觀察和臟器系數(shù)測(cè)定 試驗(yàn)期間出現(xiàn)與藥物有關(guān)的臨床癥狀或生理生化指標(biāo)明顯異常的動(dòng)物均屠宰并進(jìn)行尸體解剖學(xué)檢查，對(duì)異常的器官均進(jìn)行系統(tǒng)的組織病理學(xué)檢查；如果未見(jiàn)異常的試驗(yàn)，在停藥后第7天，各組試驗(yàn)雞隨機(jī)選取8只于采血后進(jìn)行剖檢，觀察心、肝、脾、肺、腎、法氏囊等主要臟器的病理變化，采集各臟器并稱重，計(jì)算臟器系數(shù)；同時(shí)取對(duì)照組和5倍劑量組臟器，經(jīng)福爾馬林固定后，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用EXCEL軟件進(jìn)行處理后，采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析，比較試驗(yàn)在給藥前、給藥第7天、停藥后第7天，三個(gè)試驗(yàn)組與空白對(duì)照組間各指標(biāo)差異顯著性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(Mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)差異性采用單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床表現(xiàn) 試驗(yàn)期間，黃連解毒顆粒各劑量組和對(duì)照組試驗(yàn)雞，活潑好動(dòng)，采食、飲水及糞便均正常，未發(fā)現(xiàn)死亡病例和受試藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。

3.2 生長(zhǎng)性能變化 由表1 可知，空白對(duì)照組、1倍推薦劑量組、3倍推薦劑量組、5倍推薦劑量組在平均日采食量、平均日增重量、料重比相互間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表1 各組雞的平均日采食量、平均日增重、料重比Tab 1 Average daily feed intake, average daily weight gain and feed-weight ratio of chickens in each group

3.3 給藥前、給藥第7天及停藥后第7天血常規(guī)指標(biāo) 結(jié)果(表2)表明，給藥前、給藥第7天，黃連解毒顆粒各劑量組的WBC、RBC、HGB計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)；停藥后第7天， 5倍推薦劑量組WBC相比于空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，該變化在正常范圍內(nèi)。

表2 黃連解毒顆粒對(duì)肉雞血常規(guī)指標(biāo)的影響Tab 2 Effects of Huang-Lian-Jie-Du granules on hematologic indexes in chickens

3.4 給藥前、給藥第7天及停藥第7天血液生化指標(biāo) 結(jié)果(見(jiàn)表3、表4及表5)表明：給藥前各組間ALT、AST、TP、ALBⅡ、TC、TG和UREA值無(wú)顯著差異(P>0.05)；給藥第7天、停藥第7天各劑量組ALT值相比于對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，其它各項(xiàng)血液生化指標(biāo)與對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 給藥前肉雞血液生化指標(biāo)Tab 3 Blood biochemical indexes of chickens in each group before administration

表4 給藥第7天黃連解毒顆粒對(duì)肉雞血生化指標(biāo)的影響Tab 4 The influence on blood biochemical indexes in chickens after 7 days administration

表5 停藥第7天黃連解毒顆粒對(duì)肉雞血生化指標(biāo)的影響Tab 5 The influence on blood biochemical indexes in chickens after 7 days withdrawal time

3.5 臟器指數(shù) 結(jié)果(表6)顯示：停藥第7天，黃連解毒顆粒各劑量組試驗(yàn)雞的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、肺臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)與對(duì)照組相比均沒(méi)有明顯差異(P>0.05)； 1倍推薦劑量組胸腺指數(shù)比空白對(duì)照組顯著增加(P<0.05)。

表6 停藥第7天黃連解毒顆粒對(duì)肉雞臟器指數(shù)的影響Tab 6 Effects of Huang-Lian-Jie-Du granules on organ coefficient in chickens after 7 days withdrawal time

3.6 病理變化 黃連解毒顆粒5倍推薦劑量組雞的組織病理學(xué)結(jié)果顯示，包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊在內(nèi)的主要器官均未見(jiàn)明顯異常病理變化(圖1)。

A1、B1、C1、D1、E1、F1：分別為心、肝、脾、肺、腎、法氏囊的空白對(duì)照組組織學(xué)切片；A2、B2、C2、D2、E2、F2：分別為心、肝、脾、肺、腎、法氏囊的5倍劑量組組織學(xué)切片。A1、B1、C1、D1、E1、F1：Control of heart，liver，spleen，lung，kidney，bursa of Fabricius；A2、B2、C2、D2、E2、F2：5 times dose of heart，liver，spleen，lung，kidney，bursa of Fabricius.圖1 組織病理學(xué)觀察 (HE 100×)Fig 1 Result of histopathological (HE 100×)

4 討論與結(jié)論

研究表明，黃連解毒湯具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血脂、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腸道菌群和保護(hù)胃腸黏膜等作用，該方劑中的有效化學(xué)成分為黃芩素、黃芩苷、小檗堿(又稱黃連素)及梔子苷[7]。黃連解毒湯提取物可顯著降低MAPKs磷酸化，并抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性和IκBα的降解，發(fā)揮抗炎作用[8]。該方劑對(duì)溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等均有較好的抑菌效果[9]，其中黃芩是發(fā)揮抑菌作用的主藥[10]。

本試驗(yàn)采用黃連解毒顆粒1倍、3倍、5倍推薦劑量進(jìn)行飲水給藥，結(jié)果顯示，黃連解毒顆粒各劑量給藥組雞臨床表現(xiàn)、飲食、糞便均正常，5倍劑量組雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊器官的剖檢及組織學(xué)檢查均未見(jiàn)眼觀病變。各劑量組平均日增重均高于空白對(duì)照組，料肉比均低于空白對(duì)照組，說(shuō)明黃連解毒顆粒還發(fā)揮促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用[11]，在一定程度上降低料肉比，提高經(jīng)濟(jì)效益。

ALT是肝臟受損的一項(xiàng)重要指標(biāo)[12]，給藥第7天、停藥第7天各劑量組ALT值相比于對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，同時(shí)肝臟組織切片沒(méi)有觀察到器質(zhì)性病變，表明使用黃連解毒顆粒具有一定的保護(hù)肝細(xì)胞及抗損傷作用，這與黃芩苷及黃芩素對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝毒性保護(hù)作用結(jié)果相同[13]。TC、TG值與脂代謝相關(guān)，給藥第7天，黃連解毒顆粒各劑量組TC、TG值均表現(xiàn)降低，這與小檗堿可通過(guò)增加肝臟低密度脂蛋白受體的表達(dá)來(lái)降低高膽固醇血癥患者的血漿膽固醇和甘油三酯的結(jié)果一致[14]。停藥后第7天， 5倍推薦劑量組WBC相比于空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，所有血液指標(biāo)變化均在正常范圍內(nèi)。停藥后第7天，1倍推薦劑量組脾臟和胸腺臟器指數(shù)比空白對(duì)照組有相對(duì)增加，證實(shí)黃連素發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用[15]，且1倍推薦劑量給藥提高免疫的效果最好。

綜上所述，黃連解毒顆粒5倍推薦劑量連續(xù)給藥7 d對(duì)靶動(dòng)物雞是安全的。