LC-MS/MS法測定人血漿中利奈唑胺濃度的不確定度評定

劉艷芳，張琛琛，蔡朝紅*，黨大勝（.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床試驗(yàn)研究室，沈陽 0840；.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 0840；3.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)室，沈陽 0840）

利奈唑胺（linezolid）是第一個應(yīng)用于臨床的唑烷酮類全合成抗菌藥，臨床主要用于治療耐萬古霉素屎腸球菌引起的感染、耐甲氧西林金黃葡萄球菌引起的院內(nèi)獲得性肺炎等[1]。由于利奈唑胺獨(dú)特的作用機(jī)制與現(xiàn)有抗菌藥無交叉耐藥，被認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭氏陽性菌感染的最后防線[2]。隨著利奈唑胺應(yīng)用的增多，一些較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)逐漸暴露出來[3-4]，臨床對其在中國人體藥動學(xué)研究以及特殊人群實(shí)時的血藥濃度監(jiān)測的需求越來越高，基于此本研究室建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定人血漿中利奈唑胺濃度，同時為了控制檢測質(zhì)量，達(dá)到檢測數(shù)據(jù)國際互認(rèn)的要求對方法進(jìn)行不確定度評價。

1 材料

UFLC-20AD超高速液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），3200Q-Trap質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司），Mettler MS 105分析天平（Mettler），Eppendorf 5804R低溫冷凍離心機(jī)（Eppendorf），IKA VORTEX GENIUS 3 mm-1型振蕩器（IKA VORTEX）。利奈唑胺（批號：130640-201901，純度：99.6%，規(guī)格：100 mg/支），卡馬西平（批號：100142-201706，純度：100.0%，規(guī)格：100 mg/支）（中國食品藥品檢定研究院），甲醇（批號：1099307025，色譜純，德國MERCK公司），超純水由Milli Q 型純水儀制得（Millipore，USA）。

2 方法

2.1 分析條件[5-6]

色譜柱：Waters Xterra MS C18（3.5 μm，100 mm×2.1 mm），流動相：A為純水，B為甲醇，梯度洗脫：0～2.0 min，5%～95%B；2.0～3.0 min，95%B；3.0～3.1 min，95%～5%B；3.1～5.0 min，5%B。流速：0.35 mL·min－1，柱溫：40℃，進(jìn)樣量：0.5 μL。電噴霧離子源；正離子模式；多反應(yīng)離子監(jiān)測方式；噴射電壓：4500 eV；源溫度：550℃；離子源氣體：50 psi；輔助氣：25 psi；氣簾氣：35 psi；碰撞氣：medium；掃描時間：150 ms；定量分析離子對：338.2～296.1（利奈唑胺），237.0～194.0（卡馬西平）。

2.2 溶液配制

2.2.1 系列對照品溶液 精密稱取利奈唑胺對照品22.13 mg置10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得2.20 mg·mL－1儲備液。精密移取上述儲備液適量用甲醇逐級稀釋，即得2.00、5.00、20.0、50.0、100、200、400 μg·mL－1的系列對照品溶液以及質(zhì)量濃度為4.00、40.0及320 μg·mL－1的低（QCL）、中（QCM）、高（QCH）質(zhì)控溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液配制 精密稱取卡馬西平10.79 mg置10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得1.08 mg·mL－1內(nèi)標(biāo)儲備液。精密移取23.2 mL上述內(nèi)標(biāo)儲備液置10 mL量瓶，甲醇定容得質(zhì)量濃度為2.50 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 校正標(biāo)樣/質(zhì)控樣品的制備

取對照品溶液/質(zhì)控溶液10 mL置1.5 mL離心管中，分別加入90 mL人空白血漿、10 mL內(nèi)標(biāo)溶液、700 mL甲醇，渦旋混合1 min，4℃離心10 min（1610×g），取上清液50 mL，加甲醇150 mL渦旋混合1 min，即得。

2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

yi＝axi＋b，其中yi為待測物響應(yīng)信號與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)信號之比，a為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；xi為待測物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比。

3 結(jié)果

3.1 不確定度來源

樣品測定的每一個步驟都有可能引入不確定度，本實(shí)驗(yàn)測量不確定度來源主要包括操作重復(fù)性、稱量、溶液配制、提取回收、基質(zhì)效應(yīng)、儀器量化、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等。

3.2 不確定度評定

3.2.1 重復(fù)性引入的不確定度Ur（1） 取質(zhì)控樣品QCL、QCM、QCH各6份，按“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣分析，計算質(zhì)控樣品濃度，重復(fù)進(jìn)行3組，結(jié)果見表1。

表1 利奈唑胺重復(fù)測定數(shù)據(jù) Tab 1 Repeated measurement of linezolid concentration

依據(jù)貝賽爾公式計算利奈唑胺合并樣本偏差：

公式中k為每組平行測定次數(shù)（1，2，...，n），j為組數(shù)（1，2，…，m），G為組別（L、M、H）。

經(jīng)計算：S（X，L）＝0.023 μg·mL－1，S（X，M）＝0.156 μg·mL－1，S（X，H）＝1.614 μg·mL－1

以每組平均值表示測量結(jié)果，平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差公式為：

經(jīng)計算：

測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

經(jīng)計算：Ur（1，L）＝0.0136，Ur（1，M）＝0.0088，Ur（1，H）＝0.0117。

3.2.2 稱量引入的不確定度，Ur（2） 稱量過程，天平靈敏度帶來的不確定度可忽略不計，依據(jù)計量檢定證書，所用電子天平e＝0.01 mg。按矩形分布考慮，包含因子k＝，隨機(jī)變量半寬a＝0.5e，天平的非線性誤差為：

天平自動調(diào)零引起的誤差，其 a0＝a，則天平自動調(diào)零引起的誤差為：

不考慮重復(fù)性誤差時，天平的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

利奈唑胺的稱量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.3 溶液配制引入的不確定度，Ur（3）

（1）對照品純度引入的不確定度，此項屬B類不確定度，按矩形分布處理，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液及質(zhì)控溶液配制過程引入的不確定度：配制溶液用到的移液槍為Thermo Finnpipette F3移液槍，型號為 2～20 μL（P1）、10～100 μL（P2）、20～200 μL（P3）和 100～1000 μL（P4），其容量的最大允差分別為±0.2 μL、±0.8 μL、±1.6 μL和±8 μL，10 mL量瓶（V1）最大允差為±0.020 mL。Ur（P1）＝a/（） ＝0.0058，Ur（P2）＝Ur（P3）＝Ur（P4）＝0.0046，Ur（V）＝0.000 57。

利奈唑胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程共使用10 mL量瓶（V1）1次，移液槍2～20 μL（P1）3次，10～100 μL（P2）1次，20～200 μL（P3）1次，

則利奈唑胺溶液配制整個過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.4 校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品制備引入的不確定度，Ur（4） 校正標(biāo)樣（S）和質(zhì)控樣品（G）均按照“2.3”項下方法制備，使用移液器及次數(shù)為：2～20 μL移液器2次，10～100 μL移液器2次，20～200 μL移液器1次，100～1000 μL移液器1次。標(biāo)準(zhǔn)曲線共6個點(diǎn)，則樣品相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.5 樣品提取過程引入的不確定度，Ur（5） 按“2.2.1”項下方法制備低、中、高濃度質(zhì)控樣品，每濃度6份并進(jìn)樣分析，得到與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為C；取18份空白血漿，加入700 μL甲醇，混勻，4℃離心10 min（1610×g），取上清液并加入標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液使其濃度與質(zhì)控樣品濃度相同，渦旋混合1 min后取上清液50 mL，加甲醇150 mL，渦旋混合1 min后取0.5 mL進(jìn)樣分析。每濃度6樣本分析，獲得相應(yīng)峰面積為B，則利奈唑胺在血漿樣本中的提取回收率＝C/B×100%，低、中、高濃度質(zhì)控樣品回收率分別為（94.4±9.36）%、（98.1±1.87）% 和（102.5±4.12）%。回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算公式為：

則，利奈唑胺低、中、高濃度質(zhì)控樣品回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

3.2.6 基質(zhì)效應(yīng)引入的不確定度，Ur（6） 取處理后基質(zhì)及空白溶劑配制低、高濃度質(zhì)控樣品，每濃度平行測定6次，內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)＝處理后基質(zhì)配制樣品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（A）/空白溶劑配制樣品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（B），計算得低、高濃度質(zhì)控樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為（117.1±4.64）% 和（115.5±5.75）%，基質(zhì)效應(yīng)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度計算公式為：則利奈唑胺低、高濃度質(zhì)控樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.7 儀器量化引入的不確定度，Ur（7） 所用液質(zhì)聯(lián)用儀為AB3200 Q-Trap，其中質(zhì)譜定量的最大允差為2%，液相色譜取樣的最大允差為1%，按矩形分布，儀器量化的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.8 線性擬合引入的不確定度Ur（8） 本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線除零點(diǎn)外有6個濃度點(diǎn)，連續(xù)測定6次，每個樣品中利奈唑胺峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值見表2，經(jīng)擬合曲線回算校正標(biāo)樣中利奈唑胺濃度結(jié)果見表3。

表2 利奈唑胺與內(nèi)標(biāo)峰面積比及回歸曲線參數(shù) Tab 2 Peak area ratio of linezolid with the internal standard and parameters of the calibration curves

表3 經(jīng)擬合曲線計算出的每個校正標(biāo)樣中利奈唑胺的濃度 (μg·mL－1) Tab 3 Back-calculated concentration of linezolid in standard plasma samples (μg·mL－1)

用生物樣品峰面積比的平均值對濃度以加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸（權(quán)重1/x2）得回歸方程，斜率a＝0.1557，截距b＝6.203×10－3。每個濃度重復(fù)分析的次數(shù)為6次，m＝6；標(biāo)準(zhǔn)曲線有6個濃度，n＝6；N為測定標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液的總次數(shù)，N＝m×n＝36，共測定36次；j為測定標(biāo)準(zhǔn)血漿的序數(shù)（j＝1，2，3…N）；為6個標(biāo)準(zhǔn)血漿濃度的理論平均值，＝11 μg·mL－1。

殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

用本方法測定低、中、高濃度質(zhì)控樣品各18次（P＝18），得到平均濃度

其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

按公式計算利奈唑胺低、中、高濃度質(zhì)控樣品相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則：Ur（8，L）＝0.0344；Ur（8，M）＝0.0031；Ur（8，H）＝0.0005。

3.2.9 其他因素引入的不確定度 本實(shí)驗(yàn)操作中間步驟少，過程簡單，耗時短，且樣品制備室、進(jìn)樣室等均有空調(diào)進(jìn)行溫度控制，操作過程幾乎無溫度波動，故忽略溫度影響。樣品制備過程取液前均進(jìn)行了充分震搖，有效避免取液的不均一性，因此本文忽略不均一性帶來的不確定度。

3.3 合成不確定度的評定

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度的合成 依據(jù)不確定度傳播律對各相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度進(jìn)行合成：

則利奈唑胺質(zhì)控樣品的合成相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度分別為：

利奈唑胺質(zhì)控樣品測定的合成標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

則：U（L）＝0.0276；U（M）＝0.1753；U（H）＝1.6011。

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度的擴(kuò)展 用簡易評定方法，取k＝2，此時對應(yīng)的置信概率P＝95%，得到擴(kuò)展不確定度為：UG＝k×U（G），則：UL＝0.055；UM＝0.351；UH＝3.20。

3.4 測定結(jié)果的表示

人血漿中利奈唑胺低、中、高濃度質(zhì)控的測定結(jié)果在k＝2（P＝95%）時可以分別表示 為（0.395±0.055）μg·mL－1、（4.18±0.351）μg·mL－1和（32.5±3.20）μg·mL－1。

4 討論

本文依據(jù)JJFl059-1999《測量不確定度評定與表示》[7]，中國合格評定國家認(rèn)可委頒布的CNAS-CL01-G003：2019《測量不確定度的要求》[8]和CNAS-GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[9]，參照已發(fā)表文章的方法[10-13]，按照實(shí)驗(yàn)過程尋找不確定度的來源，各不確定度分量的統(tǒng)計直方圖見圖1，由圖可知低濃度質(zhì)控樣品不確定度來源主要為提取回收、線性擬合和樣品制備，中濃度不確定度來源主要為樣品制備，高濃度不確定度來源主要為樣品制備、基質(zhì)效應(yīng)和溶液配制。

圖1 液質(zhì)聯(lián)用法測定利奈唑胺不確定度分量統(tǒng)計直方圖Fig 1 Histogram of uncertainty components in linezolid determination by LC-MS/MS

本文采用甲醇沉淀蛋白法進(jìn)行樣品提取，處理過程簡單，干擾物質(zhì)少，且方法無殘留效應(yīng)，對比中、高濃度質(zhì)控樣品不確定度結(jié)果，低濃度不確定度高主要因?yàn)镾D值較高，即操作不平行導(dǎo)致，增加操作培訓(xùn)及考核可有效避免此類問題。線性擬合對低濃度樣品的不確定度貢獻(xiàn)較大，這與同類文獻(xiàn)[10]結(jié)論一致，本文在不改變線性范圍的情況下，對標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)數(shù)進(jìn)行考察，分別用5、6、7個點(diǎn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性均合格的情況下，不確定度值大小順序?yàn)椋?點(diǎn)標(biāo)曲＞7點(diǎn)標(biāo)曲＞6點(diǎn)標(biāo)曲，因此本文采用6個點(diǎn)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時證明相同線性范圍情況下并非濃度點(diǎn)數(shù)越多越好，而要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行考察以減少線性擬合引入的不確定度。

樣品制備對低、中、高濃度質(zhì)控樣品不確定度貢獻(xiàn)均較大，此項由校正樣品和質(zhì)控樣品兩個分項共同構(gòu)成，按照公式標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)越少，樣品制備過程越簡單此項值越低，但標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)個數(shù)設(shè)置會影響線性擬合值，要進(jìn)行綜合評估來決定，可以通過優(yōu)化操作過程減少此項值。

基質(zhì)對高濃度質(zhì)控不確定度影響較低濃度大，主要是操作平行性的影響，同時若能采用穩(wěn)定同位素做內(nèi)標(biāo)，必要時改用其他離子源來降低基質(zhì)效應(yīng)從而減少不確定值。因2020年版《中國藥典》只要求對低、高濃度質(zhì)控樣品進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察，故本文未將中濃度納入基質(zhì)效應(yīng)的不確定度評價。溶液配制由對照品純度、對照品溶液配制及質(zhì)控溶液配制三分項共同構(gòu)成，可以通過提高對照品純度，減少溶液配制體積來控制不確定度結(jié)果。