梁維煒,李明娜,羅玉柱,王繼卿,柯 娜,沈繼源,郝志云,金夏陽,魯玉潔,黃兆春
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)
遼寧絨山羊主要分布于遼寧省東部山區(qū),是絨肉兼用型山羊品種,具有體型大、產(chǎn)絨量高、絨毛品質(zhì)好、遺傳性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),常被引入我國(guó)多地用于改良體型小、產(chǎn)絨低的地方山羊品種[1-3]。子午嶺黑山羊主要分布于陜西和甘肅東部地區(qū),體格中等偏小,被毛以黑色為主,以盛產(chǎn)黑猾皮和紫絨而著稱,耐粗飼,適應(yīng)性好,抗病力和抓膘能力強(qiáng)。自1965年以來,甘肅慶陽引進(jìn)遼寧絨山羊?qū)ψ游鐜X黑山羊產(chǎn)絨性能進(jìn)行改良[4]。有研究表明,遼寧絨山羊雜交改良子午嶺黑山羊,能夠顯著提高子午嶺黑山羊的產(chǎn)絨量和絨纖維品質(zhì),各代雜交羊的體重、體高、體長(zhǎng)和胸圍較同齡子午嶺黑山羊均顯著提高[5]。近期有報(bào)道研究了兩品種山羊的產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì),發(fā)現(xiàn)子午嶺黑山羊的產(chǎn)肉性能低于遼寧絨山羊,而其肉品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分高于遼寧絨山羊[6]。然而有關(guān)兩品種繁殖性能的系統(tǒng)對(duì)比相對(duì)較少。
睪丸是雄性動(dòng)物所特有的器官,在家畜的正常繁育過程中發(fā)揮著重要的作用,其能夠產(chǎn)生精子,分泌雄激素。睪丸內(nèi)含有大量的精細(xì)管,內(nèi)壁襯有生精上皮,內(nèi)嵌有支持細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞,各級(jí)生精細(xì)胞從精細(xì)管上皮的基底膜向管腔遷移的過程中持續(xù)分裂和變化,最終形成精子。精細(xì)管之間為睪丸間質(zhì),其中有間質(zhì)細(xì)胞,雄激素由間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌,對(duì)于雄性動(dòng)物維持第二性征、產(chǎn)生精子及促進(jìn)精子成熟具有重要作用。雄激素能夠直接或間接促進(jìn)生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育[7];濃度較高時(shí)可提高精子的數(shù)量和質(zhì)量[8],濃度較低時(shí)將會(huì)導(dǎo)致睪丸生殖細(xì)胞凋亡率增加[9]。因此,生精細(xì)胞數(shù)量、質(zhì)量及雄激素濃度影響雄性動(dòng)物精液品質(zhì),進(jìn)而影響其繁殖潛力[10-11]。
死盒多肽4(DEAD box polypeptide 4,DDX4)基因?yàn)镈EAD-box基因家族成員,1986年在果蠅中被發(fā)現(xiàn)[12]。DDX4在精子發(fā)生過程中的減數(shù)分裂全過程中持續(xù)高表達(dá),直至形成精子細(xì)胞,表達(dá)產(chǎn)物是精子發(fā)生的必需蛋白[13-14]。在小鼠中敲除DDX4后,雌鼠的生殖細(xì)胞發(fā)育正常,而雄鼠不育,其原因是雄性生殖細(xì)胞未能完成減數(shù)分裂而凋亡,不能產(chǎn)生精子[15]。與牦牛相比,在減數(shù)分裂阻滯、雄性不育犏牛睪丸組織中DDX4基因表達(dá)量較低[14],這與小鼠等哺乳動(dòng)物雄性不育個(gè)體睪丸中DDX4基因表達(dá)模式一致。
類無精癥缺失基因(deleted in azoospermia-like gene,DAZL)為DAZ(deleted in azoospermia)基因家族成員,編碼RNA結(jié)合蛋白,在生殖細(xì)胞中高度表達(dá),并參與調(diào)節(jié)其發(fā)育和分化,同時(shí)調(diào)控精子發(fā)生中減數(shù)分裂過程[16-17]。DAZL基因在犏牛睪丸組織中表達(dá)水平低于黃牛和牦牛,參與犏牛精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂調(diào)控[18]。DAZL表達(dá)量在湖羊性成熟時(shí)達(dá)到高峰,DAZL在睪丸發(fā)育中發(fā)揮重要作用[19]。李討討等[20]發(fā)現(xiàn),綿羊不同發(fā)育階段各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量不同,與DAZL基因表達(dá)量高低有關(guān)。
基于以上研究背景,本研究采集性成熟、健康的純種遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊睪丸,通過大體解剖、石蠟包埋結(jié)合HE染色等方法分析兩品種間睪丸發(fā)育程度;同時(shí)采用ELISA測(cè)定雄激素含量,RT-qPCR、Western blot方法測(cè)定生殖標(biāo)記基因(DDX4和DAZL)在兩品種山羊睪丸組織中表達(dá)水平,旨在比較兩品種山羊繁殖性能是否存在差異,為將來在生產(chǎn)實(shí)踐中遼寧絨山羊改良子午嶺黑山羊繁殖性能提供參考依據(jù)。
本試驗(yàn)選取相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下,生長(zhǎng)發(fā)育正常,健康的9月齡純種遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊公羔(各5只,共10只)為試驗(yàn)動(dòng)物,飼養(yǎng)過程中所有羊均未進(jìn)行配種。相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下,9月齡遼寧絨山羊的宰前活重和胴體重分別為31.09和14.10 kg,分別極顯著高于同齡子午嶺黑山羊的18.21和7.45 kg(P<0.01)[6],解剖分離出兩側(cè)睪丸,用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗除血后稱量?jī)蓚?cè)睪丸總重,右側(cè)睪丸用于測(cè)量睪丸長(zhǎng)、短周徑,左側(cè)睪丸用于試驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)的取樣:沿睪丸長(zhǎng)軸縱向剖開,取橫切面中間部位相同大小的睪丸組織分別儲(chǔ)存于液氮和4%多聚甲醛溶液中,用于后續(xù)試驗(yàn)。
1.2.1 睪丸表觀參數(shù)測(cè)定 參考《羊生產(chǎn)學(xué)》[21],測(cè)量山羊的兩側(cè)睪丸總重。測(cè)量睪丸長(zhǎng)周徑、睪丸短周徑[22],計(jì)算睪丸臟體比和睪丸胴體比。睪丸臟體比=睪丸總重/宰前活重,睪丸胴體比=睪丸總重/胴體重。
1.2.2 雄激素濃度測(cè)定 準(zhǔn)確稱取新鮮睪丸組織,0.9%生理鹽水按1∶9(w/v)稀釋后勻漿,5 000 r·min-1離心10 min,取上清液,制成10%的勻漿待測(cè)。用山羊雄激素ELISA試劑盒(ZC-51511,茁彩)測(cè)定睪丸組織中雄激素濃度,具體操作步驟參照試劑盒使用說明書。
1.2.3 石蠟切片的制作及HE染色 將固定于4%多聚甲醛溶液溶液中的睪丸組織,經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、脫蠟、水化、蘇木精-伊紅(Hematoxylin -eosin,HE)染色、脫水、透明和封片制成切片。采用熒光掃描顯微鏡(P250 Flash,丹吉爾)觀察切片。
1.2.4 總RNA提取及cDNA合成 將睪丸組織分別加入液氮充分研磨后,YransZol RNA提取試劑盒(ET101,全式金)提取睪丸組織總RNA。采用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒(KR118,天根)對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,具體操作步驟參照試劑盒使用說明書。獲得的cDNA產(chǎn)物于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5 引物設(shè)計(jì)與合成 從 GenBank 數(shù)據(jù)庫中檢索山羊DDX4基因(XM_005694694.3)、DAZL基因(JX273761.1)和內(nèi)參基因β-actin(NM_001314342.1)mRNA 序列,利用Primer Premier 3.0 軟件設(shè)計(jì)引物,并進(jìn)行BLAST檢測(cè)后,將引物序列信息(表1)發(fā)送至楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。
表1 引物序列信息Table 1 Information of primer sequence
1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermo Fisher,USA)對(duì)睪丸組織中DDX4和DAZLmRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),以β-actin為內(nèi)參。在八聯(lián)管的每個(gè)孔中先加入10 μL 2×SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11720,艾科瑞),各0.4 μL上、下游引物和7.2 μL ddH2O,最后加入2 μL cDNA,每個(gè)樣做3次重復(fù)。將八聯(lián)管置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中,先95 ℃預(yù)變性3 min;再95 ℃變性10 s,60 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸30 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,95 ℃變性15 s。采用2-ΔΔCt計(jì)算方法對(duì)RT-qPCR結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。
1.2.7 免疫印跡(Western blot)分析 采用全蛋白提取試劑盒(BC3711,索萊寶)提取睪丸組織總蛋白,采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012,碧云天)檢測(cè)睪丸組織總蛋白濃度,定量后按比例加入4× 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)上樣緩沖液,煮沸10 min使蛋白變性,于-20 ℃保存。每孔上樣8 μL變性蛋白,以GAPDH (D110016,生工)為內(nèi)參,12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis,SDS-PAGE)進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉后,分別加入兔源DDX4一抗(1∶300)(D161611,生工)、兔源DAZL一抗(1∶300)(bs-12245R,博奧森)和兔源GAPDH一抗(1∶1 500)(D110016,生工)4 ℃孵育過夜。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗膜,用山羊抗兔二抗(1:5 000)(D111018,生工),37 ℃孵育1.5 h,PBS洗膜。用底物化學(xué)發(fā)光液(electrochemi-luminescence,ECL)顯影曝光,并觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
使用Image J圖像分析軟件測(cè)定Western blot結(jié)果。采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和顯著性分析,結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。
由表2可知,遼寧絨山羊的睪丸總重和睪丸長(zhǎng)周徑極顯著高于子午嶺黑山羊(P<0.01);遼寧絨山羊的睪丸短周徑、睪丸臟體比和睪丸胴體比,與子午嶺黑山羊差異不顯著(P>0.05)。
表2 遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊睪丸表觀參數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 2 Testicular apparent parameters of Liaoning cashmere goat and Ziwuling black goat
石蠟包埋結(jié)合HE染色觀察兩品種睪丸組織(圖1),發(fā)現(xiàn)精細(xì)管橫切面均為中空的同心圓狀結(jié)構(gòu),遼寧絨山羊生精上皮內(nèi)細(xì)胞層數(shù)較子午嶺黑山羊多且排列緊密。進(jìn)一步測(cè)定生精上皮厚度、精細(xì)管的面積、直徑和單位面積內(nèi)精細(xì)管數(shù)量等指標(biāo)(表3),結(jié)果表明,遼寧絨山羊睪丸生精上皮厚度顯著高于子午嶺黑山羊(P<0.05),而兩品種間精細(xì)管的面積、直徑及睪丸單位面積內(nèi)精細(xì)管數(shù)量沒有顯著差異(P>0.05)。
圖1 遼寧絨山羊(A、B)和子午嶺黑山羊(C、D)睪丸HE染色石蠟切片F(xiàn)ig.1 HE staining of Liaoning cashmere goat (A,B)and Ziwuling black goat (C,D)testes
表3 遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊睪丸組織形態(tài)學(xué)比較切片結(jié)果Table 3 Comparision of testicular histomorphology between Liaoning cashmere goat and Ziwuling black goat
采用ELISA檢測(cè)睪丸內(nèi)雄激素濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),遼寧絨山羊睪丸內(nèi)雄激素濃度高于子午嶺黑山羊睪丸內(nèi)雄激素濃度,但沒有顯著差異(P>0.05,圖2)。
LC.遼寧絨山羊;ZB.子午嶺黑山羊;**.差異極顯著(P<0.01);*.差異顯著(P<0.05)。下同LC.Liaoning cashmere goat;ZB.Ziwuling black goat;**.Extremely significant difference;*.Significant difference.The same as below圖2 遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊睪丸中雄激素濃度Fig.2 Androgen concentration in testis of Liaoning cashmere goat and Ziwuling black goat
DAZL和DDX4是重要的生殖細(xì)胞標(biāo)記基因,采用RT-qPCR檢測(cè)遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊睪丸組織中DDX4和DAZLmRNA的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果如圖3,兩基因在遼寧絨山羊中的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于子午嶺黑山羊(P<0.01)。
圖3 遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊睪丸中DDX4和DAZL mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of DDX4 and DAZL mRNA in testis of Liaoning cashmere goat and Ziwuling black goat
采用Western blot技術(shù)檢測(cè)遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊睪丸組織中DDX4和DAZL蛋白的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果如圖4A所示,DDX4和DAZL蛋白在遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊睪丸組織中均有表達(dá),但其表達(dá)豐度略有差異?;叶戎捣治鼋Y(jié)果表明,遼寧絨山羊睪丸組織中DDX4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于子午嶺黑山羊(P<0.05),而DAZL蛋白相對(duì)表達(dá)量在兩品種間無差異,但有上調(diào)趨勢(shì)(P>0.05)(圖4B)。
A.DDX4和DAZL蛋白的Western blot分析;B.DDX4和DAZL蛋白的相對(duì)表達(dá)量A.Western blot analysis for DDX4 and DAZL protein;B.The relative level of DDX4 and DAZL protein expression圖4 遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊睪丸組織中DDX4和DAZL蛋白的表達(dá)結(jié)果Fig.4 Expression of DDX4 and DAZL protein in testicular tissue of Liaoning cashmere goat and Ziwuling black goat
據(jù)《羊志》[23]記載,遼寧絨山羊公、母羊5~7月齡性成熟,15~18月齡進(jìn)行初配;子午嶺黑山羊公、母羊均6月齡左右性成熟,8月齡配種。本研究選取9月齡遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊作為研究對(duì)象,此時(shí)兩品種均已達(dá)到性成熟,生殖器官已發(fā)育成熟,表明兩品種的繁殖性能基本趨于穩(wěn)定,可用于睪丸發(fā)育程度分析。同時(shí)比較兩品種睪丸發(fā)育,可作為將來評(píng)定其繁殖潛力的基礎(chǔ)資料。
宰前活重和胴體重等指標(biāo)因動(dòng)物品種不同而存在顯著差異[24]。遼寧絨山羊的宰前活重和胴體重均極顯著高于子午嶺黑山羊(P<0.01)[6],表明遼寧絨山羊生長(zhǎng)發(fā)育較子午嶺黑山羊快,這與其他文獻(xiàn)中的報(bào)道相一致,即遼寧絨山羊生長(zhǎng)發(fā)育比當(dāng)?shù)厣窖蚩靃25-26]。不同品種豬睪丸重量和大小存在顯著差異[27],本研究發(fā)現(xiàn),遼寧絨山羊雙側(cè)睪丸較子午嶺黑山羊重,睪丸長(zhǎng)周徑較子午嶺黑山羊長(zhǎng),而睪丸短周徑、睪丸臟體比和睪丸胴體比無差異,表明遼寧絨山羊生長(zhǎng)發(fā)育快,性腺也相應(yīng)較大且重,但從睪丸器官指數(shù)相關(guān)指標(biāo)來看,9月齡的遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊性腺發(fā)育程度基本一致。
精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜的生物學(xué)過程,涉及一系列細(xì)胞增殖和分化,如精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂、功能精子的形成等[28-29]。精細(xì)管是精子發(fā)生的主要場(chǎng)所,精子發(fā)生始于精細(xì)管上皮的基底膜處,逐漸向管腔移動(dòng),最終形成蝌蚪狀的精子,頭部嵌于支持細(xì)胞近腔端,尾部游離于管腔中。本研究中對(duì)睪丸組織形態(tài)學(xué)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),遼寧絨山羊精細(xì)管面積、直徑和單位面積精細(xì)管數(shù)量與子午嶺黑山羊無顯著差異;然而遼寧絨山羊睪丸生精上皮厚度顯著高于子午嶺黑山羊。生精上皮中嵌合各級(jí)生精細(xì)胞,由此推測(cè),兩品種生殖上皮厚度的差異可能是由生精細(xì)胞數(shù)量差異引起的,這有待于進(jìn)一步通過分子生物學(xué)方法驗(yàn)證。
睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌雄激素[30],對(duì)雄性生殖器官的生長(zhǎng)、精子發(fā)生和雄性第二性征的維持有著促進(jìn)作用[31]。有研究表明,雄激素水平與睪丸生殖細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[9];同時(shí),雄激素又參與調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和分化[32]。因此,為進(jìn)一步分析兩品種睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量是否有差異,本研究采集相同部位的睪丸組織測(cè)定雄激素濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),遼寧絨山羊睪丸組織中雄激素濃度與子午嶺黑山羊無顯著差異,表明兩品種山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞分泌激素的能力差異不顯著,且雄激素對(duì)睪丸生殖細(xì)胞凋亡的影響也不顯著。
精子發(fā)生過程中生殖細(xì)胞的發(fā)育受DAZL基因調(diào)控,該基因是提高雄性動(dòng)物繁殖能力所必需的[33]。DAZL在湖羊不同發(fā)育階段睪丸中的表達(dá)量不同,特別是在性成熟后睪丸中的表達(dá)最高[34]。付永[18]發(fā)現(xiàn),犏牛雄性不育,與DAZL在犏牛睪丸組織中低表達(dá)有關(guān)。DDX4表達(dá)的開始與精原細(xì)胞的形成有關(guān)[13],DDX4 基因特異表達(dá)于生殖細(xì)胞系[35],是調(diào)控哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞增殖和分化必不可少的[36],同時(shí),哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的形成可能取決于其與性腺體細(xì)胞的相互作用[37]。本研究發(fā)現(xiàn),DAZL和DDX4 mRNA在遼寧絨山羊睪丸中表達(dá)量顯著高于子午嶺黑山羊。DDX4蛋白在遼寧絨山羊睪丸中的表達(dá)量高于子午嶺黑山羊,這與DDX4 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致。DAZL蛋白在兩品種間表達(dá)無差異,但呈上調(diào)趨勢(shì),這與Yuan等[19]研究結(jié)果一致,即大睪丸中DAZL豐度高于小睪丸,但差異不顯著。因此生殖細(xì)胞標(biāo)記基因在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,生殖細(xì)胞標(biāo)記基因的差異表達(dá)能夠反映出遼寧絨山羊的生殖細(xì)胞數(shù)量可能較子午嶺黑山羊多,進(jìn)而影響生精能力,這也印證了兩品種生精上皮厚度存在顯著差異。然而,本研究未針對(duì)兩品種山羊精液品質(zhì)及精子活率等指標(biāo)做詳細(xì)比對(duì),下一步本課題組將采集適配公羊的精液進(jìn)行比對(duì)分析,深入剖析兩品種公羊的繁殖力。
遼寧絨山羊成年母羊產(chǎn)羔率110%~120%,斷奶羔羊成活率95%以上[38],產(chǎn)雙羔率21.28%[39];子午嶺黑山羊產(chǎn)羔率103.57%[40],產(chǎn)雙羔率2%~4%[41]。同時(shí),根據(jù)《羊志》[23]中關(guān)于遼寧絨山羊和子午嶺黑山羊性成熟月齡及初配年齡的記載,推測(cè)遼寧絨山羊繁殖性能較子午嶺黑山羊高。生產(chǎn)實(shí)踐中利用遼寧絨山羊改良子午嶺黑山羊,不僅對(duì)子午嶺黑山羊的產(chǎn)絨性能和生長(zhǎng)性能有所提升,推測(cè)雜交后代的繁殖性能也會(huì)得到改良。
性成熟的遼寧絨山羊生長(zhǎng)發(fā)育速度較子午嶺黑山羊快,睪丸器官指數(shù)無顯著差異。組織形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),遼寧絨山羊精細(xì)管上皮厚度較子午嶺黑山羊厚,生殖標(biāo)記基因表達(dá)量存在顯著差異。推測(cè)性成熟后遼寧絨山羊生精能力較子午嶺黑山羊高,生產(chǎn)實(shí)踐中引進(jìn)遼寧絨山羊雜交改良子午嶺黑山羊,對(duì)其繁殖性能可能會(huì)有所提升。