趙方建，劉 唯 綜述，陳 鍵審校

湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)二部，湖南長(zhǎng)沙 410000

銅綠假單胞菌(PA)是一種革蘭陰性的條件致病菌，同時(shí)也是常見(jiàn)的醫(yī)院內(nèi)感染菌，在2020年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)研究中位于非發(fā)酵菌分離率首位[1]。其產(chǎn)生的外毒素、彈性蛋白酶、綠膿素等多種致病產(chǎn)物，可引起包括呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、皮膚傷口和手術(shù)切口在內(nèi)的多方式多部位的感染，在兒童重癥血流感染中病死率甚至可達(dá)到76%[2]。研究表明PA可通過(guò)形成生物膜逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除和抗菌藥物的殺傷，生物膜中細(xì)菌抗性甚至比浮游菌高1 000倍[3]，而群體感應(yīng)(QS)系統(tǒng)是調(diào)控PA生物膜形成和毒力因子產(chǎn)生的最重要的因素之一，QS系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，直接或間接導(dǎo)致了細(xì)菌生物膜的形成和毒力增強(qiáng)。近年來(lái)各類廣譜抗菌藥物及導(dǎo)管、內(nèi)鏡等侵入性操作的大量應(yīng)用，更是加重了這一效應(yīng)，因此對(duì)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)(PA-QS)系統(tǒng)調(diào)控生物膜的進(jìn)一步研究尤為必要，本文就QS系統(tǒng)調(diào)控PA生物膜形成的機(jī)制，綜合國(guó)內(nèi)外相關(guān)課題研究工作和成果，尋找更多可能的應(yīng)對(duì)策略，為臨床治療PA感染提供理論依據(jù)。

1 QS系統(tǒng)

1.1QS系統(tǒng)的定義 QS系統(tǒng)廣泛存在于各類細(xì)菌中，PA-QS系統(tǒng)調(diào)控生物膜形成則是在1998年由DAVIES等[3]首次報(bào)道，發(fā)現(xiàn)LasI-RhlI雙突變體PA菌株生物膜厚度僅為野生型菌株的20%，野生型菌株生物膜為成熟的蘑菇狀，而突變型菌株生物膜為片狀且不連續(xù)[3]。PA-QS系統(tǒng)主要通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中分泌自體誘導(dǎo)分子(AI)實(shí)現(xiàn)，細(xì)菌將此類信號(hào)分子分泌至胞外環(huán)境中，當(dāng)細(xì)菌繁殖到一定密度，信號(hào)分子積聚到一定的閾值時(shí)可激發(fā)細(xì)菌QS系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)和正反饋通路，誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)特定環(huán)境條件作出反應(yīng)，包括群集運(yùn)動(dòng)、毒力基因的表達(dá)、形成生物膜，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌侵襲性、耐藥性、免疫逃逸性的增強(qiáng)。

1.2QS系統(tǒng)的組成 QS系統(tǒng)已知主要由Las系統(tǒng)、Rh1系統(tǒng)和喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)這3種子系統(tǒng)組成，研究表明3種子系統(tǒng)存在級(jí)聯(lián)調(diào)控，其中Las系統(tǒng)處于系統(tǒng)調(diào)節(jié)的上游位置，是整個(gè)QS系統(tǒng)的主控因子，Las系統(tǒng)由LasI基因與受體蛋白LasR組成，LasI指導(dǎo)?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)分子N-3-氧代-十二烷?；?高絲氨酸內(nèi)酯的合成，AHL與受體蛋白LasR結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物，激活LasI基因自身相關(guān)毒力因子包括LasA蛋白酶、LasB彈性蛋白酶、堿性磷酸酶等下游靶基因的表達(dá)。另一方面，與Las系統(tǒng)類似，Rh1系統(tǒng)由RhlI基因和受體蛋白R(shí)h1R兩部分組成，RhlI指導(dǎo)合成信號(hào)分子N-丁?；呓z氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)，C4-HSL則與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Rh1R結(jié)合作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物，參與調(diào)控Rh1AB等相關(guān)基因表達(dá)，指導(dǎo)鼠李糖脂、氰化物、綠膿菌素的合成[4]。而喹諾酮系統(tǒng)是由信號(hào)分子2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(PQS)和其受體蛋白PqsR組成，先是由MvfR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子激活操縱子PqsABCDE基因的轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物指導(dǎo)合成PQS的直接前體4-羥基-2-庚基-喹諾酮(HHQ)，HHQ通過(guò)單加氧酶催化成為PQS，繼而與PqsR結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物，指導(dǎo)綠膿菌素等毒力因子的表達(dá)。其中MvfR和單加氧酶的操縱子均受上游Las系統(tǒng)的正向調(diào)控，同時(shí)PqsABCDE基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生操縱子PqsE，而PqsE可以激活Rh1系統(tǒng)的表達(dá)，故可視喹諾酮系統(tǒng)為L(zhǎng)as系統(tǒng)與Rh1系統(tǒng)的橋梁，其直接受Las系統(tǒng)、Rh1系統(tǒng)的調(diào)控，同時(shí)又調(diào)控著Rh1系統(tǒng)[5-6]。隨著研究深入，越來(lái)越多新的子系統(tǒng)和調(diào)控旁路被發(fā)現(xiàn)，例如一種新的IQS系統(tǒng)子系統(tǒng)，其AI結(jié)構(gòu)為2-(2-羥基苯基)-噻唑-4-碳醛。在缺乏磷酸鹽的環(huán)境下IQS系統(tǒng)可以替代部分Las系統(tǒng)的功能，接管喹諾酮系統(tǒng)和Rh1系統(tǒng)的表達(dá)，其可以將QS系統(tǒng)與環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)結(jié)合起來(lái)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[7]。由此可以得知，QS系統(tǒng)的幾個(gè)子系統(tǒng)相互交織，控制著數(shù)百個(gè)靶基因的表達(dá)，也受多個(gè)信號(hào)旁路調(diào)控。同時(shí)Las系統(tǒng)的失活不一定會(huì)造成毒力因子表達(dá)的癱瘓，這為研究提供了新的思路，那就是Rh1系統(tǒng)及喹諾酮系統(tǒng)同樣在QS系統(tǒng)中同樣扮演重要角色，需從QS系統(tǒng)全局出發(fā)尋找更多群感抑制的替代方案。

2 生物膜

2.1生物膜的形成 PA生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，初期是由浮游細(xì)菌黏附在宿主或物體表面形成微菌落狀態(tài)，細(xì)菌通過(guò)Ⅳ型菌毛的蹭行運(yùn)動(dòng)聚集形成群落狀態(tài)，其中細(xì)菌的黏附、群集及Ⅳ型菌毛均受Las/Rh1系統(tǒng)基因的調(diào)控。群落狀態(tài)的細(xì)菌產(chǎn)生并分泌胞外多聚物(EPS)，利用EPS形成較穩(wěn)定的立體結(jié)構(gòu)直至生物膜成熟。EPS主要由胞外多糖、鼠李糖脂、胞外eDNA、蛋白質(zhì)組成[8]，形成的生物膜含有微米大小的微孔水通道用于物質(zhì)交換，包括空氣、水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，代謝廢物的排出，細(xì)菌可以利用孔道進(jìn)行信息交換[9]。胞外多糖主要由藻酸鹽、psl多糖、pel多糖組成，psl和pel多糖均由相關(guān)基因編碼的酶系合成。而QS系統(tǒng)調(diào)控合成的藻酸鹽作為胞外多聚物的主要成分，是細(xì)菌生物膜物理結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，起到生物膜“支架”的作用[10]，同時(shí)藻酸鹽具有抗原性，能限制巨噬細(xì)胞的吞噬和炎癥因子介導(dǎo)，干擾宿主的免疫反應(yīng)[11]。這也是黏液型PA更能抵抗藥物和宿主的攻擊，引起感染遷延不愈的原因。

2.2生物膜的耐藥機(jī)制 生物膜細(xì)菌耐藥性是多因素共同作用導(dǎo)致的，生物膜為細(xì)菌提供了物理屏障，抗菌藥物難以滲透，當(dāng)藥物作用于細(xì)菌時(shí)，其濃度已經(jīng)遠(yuǎn)小于體外藥敏實(shí)驗(yàn)所需的抑制濃度[12]。同時(shí)生物膜中的酶類可以將抗菌藥物酶解，使生物膜局部的藥物濃度降低，以達(dá)到保護(hù)細(xì)菌的目的。加之生物膜深部細(xì)菌代謝廢物的積聚，局部理化性質(zhì)改變，例如pH值的下降和低氧環(huán)境，抗菌藥物的作用環(huán)境惡劣，限制了其抗菌活性[13]。此外，因?yàn)镋PS組成成分使生物膜具有攜帶負(fù)電荷的屬性，當(dāng)多黏菌素B和妥布霉素此類帶有正電荷的藥物與生物膜接觸時(shí)可被其阻滯在表面而降低效能[10,14]。最后，生物膜的厚度增加使得下層細(xì)菌處于缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的環(huán)境，細(xì)菌可以誘導(dǎo)自身進(jìn)入“休眠狀態(tài)”，對(duì)外界刺激的敏感性下降，耐藥性增強(qiáng)，這也是造成PA慢性感染和定植的重要原因[15]。上述機(jī)制說(shuō)明，QS系統(tǒng)所表達(dá)的產(chǎn)物對(duì)生物膜的功能實(shí)現(xiàn)起到支撐作用，同時(shí)也揭示了體外藥敏試驗(yàn)提示細(xì)菌敏感，但臨床抗菌治療時(shí)卻往往效果較差的真相，這與生物膜對(duì)細(xì)菌的多重保護(hù)有著密不可分的關(guān)系，需從生物膜生成的源頭解決問(wèn)題。

3 QS的應(yīng)對(duì)策略

3.1群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制劑(QSIs) QSIs是一類可以靶向作用于QS系統(tǒng)并抑制其功能表達(dá)的一類物質(zhì)，相較于傳統(tǒng)的抗菌藥物，其通過(guò)阻斷細(xì)菌之間的通訊機(jī)制發(fā)揮作用而不直接殺死細(xì)菌和對(duì)其生長(zhǎng)造成影響，因此該策略產(chǎn)生的選擇壓力較低并降低了治療過(guò)程中細(xì)菌耐藥性發(fā)展速度。

3.2植物提取物的QSIs活性 因?yàn)樽匀唤缰参锓N類的多樣性，植物中可提取出對(duì)QS系統(tǒng)具有抑制作用的化合物，該類物質(zhì)具有安全、低毒、環(huán)保的特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)始致力于尋找植物中潛在的QSIs，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)生姜、大蒜、甘草、綠茶、羌活、鼠尾草、亞油酸等多種植物中的提取物具有QSIs活性，可抑制PA-QS系統(tǒng)毒力因子的表達(dá)和生物膜的形成[15-23]。其中研究較多的是生姜的提取物，研究發(fā)現(xiàn)生姜中具有姜黃素、姜油醇、姜辣素、棉子糖等多種QSIs活性物質(zhì)，并進(jìn)行了姜黃素與阿奇霉素聯(lián)用[15]、與金屬銅結(jié)合[24]、與納米材料結(jié)合[19]對(duì)QS系統(tǒng)抑制作用的研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素具有良好的QSIs性能。上述天然提取物的QSIs作用機(jī)制也有所不同，其中大蒜中二烯丙基硫化物攜帶的硫醚基團(tuán)可抑制3個(gè)子系統(tǒng)的AI受體活性[16]，亞油酸調(diào)控了細(xì)菌第二信使環(huán)二鳥(niǎo)苷酸的降解[18]，而姜辣素衍生物競(jìng)爭(zhēng)性抑制了AHL和C4-HSL與受體的結(jié)合[20]，減少生物膜形成和毒力因子的產(chǎn)生。但除此之外的大多數(shù)研究?jī)H停留在轉(zhuǎn)錄層面，僅對(duì)QS系統(tǒng)基因的表達(dá)和毒力因子的產(chǎn)生進(jìn)行分析，而對(duì)具體作用機(jī)制的探索較少，同時(shí)僅有少數(shù)研究進(jìn)行了秀麗隱桿線蟲(chóng)或小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，天然QSIs的體內(nèi)活性和不良反應(yīng)尚未明確，這是都是今后的重點(diǎn)研究方向。

3.3抗菌藥物作為QSIs PA作為產(chǎn)生物膜的典型菌種具有多重耐藥特點(diǎn)，抗菌藥物的濫用更是加重了細(xì)菌的選擇壓力，所以需要更合理的抗菌藥物應(yīng)用策略，而臨床常用的大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物如阿奇霉素、紅霉素和克拉霉素已被證明具有良好的QSIs活性。研究顯示，在亞抑菌濃度阿奇霉素的處理下，實(shí)驗(yàn)組的臨床分離菌均未能產(chǎn)生C4-HSL分子，其鼠李糖脂、蛋白酶、生物膜的產(chǎn)生均大幅減少[21]，而紅霉素同樣有類似的作用，其原理是抑制了LasR、PqsA等基因的表達(dá)和細(xì)菌的群集[25]，同時(shí)阿奇霉素和克拉霉素在與慶大霉素等藥物聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同作用[26]。而對(duì)于β內(nèi)酰胺類抗菌藥物相關(guān)研究較少，有研究者將頭孢哌酮與金屬鐵、鈷結(jié)合，其衍生物表現(xiàn)出對(duì)QS系統(tǒng)的抑制作用，原理是藥物與AI受體結(jié)合使其失活[23]。還有研究發(fā)現(xiàn)頭孢他啶在亞抑菌濃度下可減少凝集素LecA、LecB、Pel、Psl基因的表達(dá)[27]。與之相反，國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)在治療PA慢性感染時(shí)頭孢他啶使QS系統(tǒng)基因表達(dá)增加[24]，這或許是細(xì)菌對(duì)于不良刺激的應(yīng)激反應(yīng)所致，值得進(jìn)一步研究。此外近年來(lái)還有少數(shù)對(duì)于氨基糖苷類和喹諾酮類藥物的研究，例如慶大霉素、左氧氟沙星在亞抑菌濃度下降低了QS系統(tǒng)相關(guān)毒力因子的表達(dá)[28]。在環(huán)丙沙星與阿米卡星聯(lián)用時(shí)，可以殺滅低耐藥浮游菌，但對(duì)細(xì)菌生物膜的根除效益不明顯[29]。綜上所述，各類抗菌藥物均被證實(shí)具有不同程度的QSIs活性。其中大環(huán)內(nèi)酯類抑制作用顯著，并且與其他藥物聯(lián)用時(shí)起到協(xié)同作用，增強(qiáng)抗菌效能，故臨床對(duì)PA感染的治療過(guò)程中可考慮聯(lián)用此類抗菌藥物及延長(zhǎng)給藥時(shí)間以達(dá)到更好的抗菌效能，而頭孢他啶因?yàn)槠銺SIs作用尚未明確，在治療慢性PA感染時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎使用，以延緩PA耐藥性的發(fā)展。

3.4人工合成的QSIs 通過(guò)對(duì)天然QSIs分子結(jié)構(gòu)的了解，讓人工合成QSIs成為可能，而廣泛存在于各類植物中的鹵代呋喃酮就是典型代表，鹵代呋喃酮的QSIs活性于1993年首次在紅藻中被發(fā)現(xiàn)[30]，其具有與AHL類似的結(jié)構(gòu)，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合lasR受體抑制QS系統(tǒng)，但天然呋喃酮對(duì)QS系統(tǒng)的抑制作用極為有限，因此對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾以提高QSIs活性成為研究的焦點(diǎn)，其中對(duì)于溴化呋喃酮(C-30)的研究較多，既往的研究普遍認(rèn)為C-30主要通過(guò)抑制LasR受體來(lái)發(fā)揮QSIs作用，但最近研究發(fā)現(xiàn)，C-30可獨(dú)立于LasR抑制Rh1R并同樣具有顯著活性，同時(shí)C-30對(duì)的QS系統(tǒng)的抑制可能不在基因水平，而可能在轉(zhuǎn)錄后水平[31]，這超出了人們既往的認(rèn)知，也說(shuō)明呋喃酮衍生物的潛力還有待發(fā)掘。與此同時(shí)，受呋喃酮的啟發(fā)，有研究者通過(guò)引入硫醚基團(tuán)或苯基脲基團(tuán)合成了四類新型L-高絲氨酸內(nèi)酯類似物，發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈末端連接有苯基脲基團(tuán)的11f化合物對(duì)QS系統(tǒng)基因的表達(dá)、毒力因子的產(chǎn)生和細(xì)菌群集的抑制作用均強(qiáng)于C-30，有著優(yōu)異的QSIs活性[25]。上述研究再一次說(shuō)明，QSIs的功能往往是由其特有的分子結(jié)構(gòu)所實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)對(duì)于AI的活性基團(tuán)和靶受體功能位點(diǎn)的剖析，可以人為修飾甚至創(chuàng)造所需要的QSIs，此類物質(zhì)相較于天然提取物更具有針對(duì)性和高效性，具有廣泛的前景。但另一方面，人工合成QSIs少有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，其體內(nèi)毒性和人體的安全性還有待論證。

3.5其他類型的QSIs 近年來(lái)隨著藥物的研發(fā)難度愈發(fā)增大，“老藥新用”成為一個(gè)新的研究策略，研究者發(fā)現(xiàn)了一些非抗菌藥物同樣具有QSIs活性，西格列汀作為治療2型糖尿病的一線用藥，被發(fā)現(xiàn)具有結(jié)合AI受體的特性，在2 mg/mL濃度下顯著抑制了PA生物膜、綠膿素、彈性蛋白酶等毒力因子的生成和QS系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)[32]。別嘌呤醇在200 μg/mL的濃度下也具有和西格列汀類似的作用，其機(jī)制同樣是與QS系統(tǒng)相關(guān)受體結(jié)合起到抑制作用[26]。而非甾體類藥物的研究則更多，其中布洛芬[33]、美洛昔康[27]、撲熱息痛[34]均被證明存在QSIs活性，布洛芬在75 μg/mL時(shí)對(duì)QS系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)最為明顯，而如果要對(duì)綠膿素、鼠李糖脂等毒力因子的顯著抑制則需要達(dá)到100 μg/mL甚至更高，美洛昔康在15.63 μg/mL濃度下發(fā)揮QSIs作用，并表現(xiàn)出對(duì)于抗菌藥物的協(xié)同作用。上述藥物在亞抑菌濃度下對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)均沒(méi)有抑制作用，所以不會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生選擇壓力，具有廣泛的應(yīng)用前景，通過(guò)進(jìn)一步藥理研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，或許能給PA的臨床治療提供新的選擇，同時(shí)節(jié)省了研制新藥所需的大量時(shí)間、金錢和精力。

4 小 結(jié)

隨著近年來(lái)QS系統(tǒng)調(diào)控PA生物膜形成機(jī)制研究的深入，雖然種類繁多的QSIs被發(fā)現(xiàn)，但仍然沒(méi)有找到能有效根除體內(nèi)PA生物膜的辦法，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益加劇，抗菌藥物的作用也在快速弱化，所以尋找新的QS抑制策略十分急迫，目前所發(fā)現(xiàn)的QSIs仍然存在體內(nèi)毒性未知，起效濃度過(guò)高，穩(wěn)定性差，易降解等諸多問(wèn)題，限制了QSIs的進(jìn)一步研究，但近年細(xì)菌環(huán)二鳥(niǎo)苷酸信使分子，sRNA調(diào)控旁路和外排泵的研究已有較大進(jìn)展，同時(shí)結(jié)合計(jì)算機(jī)對(duì)接分析、分子動(dòng)力學(xué)模擬，以及化學(xué)成分的吸收、分布、代謝、排泄、毒性進(jìn)行分析等新興技術(shù)可對(duì)QSIs進(jìn)行篩選和處理[33-34]，繼續(xù)加大對(duì)已有藥物的研究和中醫(yī)藥的發(fā)掘，相信不久的將來(lái)會(huì)有更多優(yōu)異的QSIs和QS抑制策略被發(fā)現(xiàn)，并應(yīng)用于臨床。