內(nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根生長(zhǎng)和次生代謝的影響

朱畇昊 張夢(mèng)佳 彭淑萍 董誠(chéng)明,2,*

(1 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)為玄參科(Scrophulariaceae)多年生草本植物，主要以其新鮮或干燥塊根入藥[1]，全國(guó)各地均有栽培，以懷地黃為佳。近年有研究發(fā)現(xiàn)，地黃的化學(xué)成分以萜類(lèi)化合物中的環(huán)烯醚萜苷類(lèi)為主，此外還含有糖類(lèi)、氨基酸、微量元素以及脂肪酸等其他成分，具有強(qiáng)心利尿、抗炎解熱、促進(jìn)血液凝固和降低血糖等作用[2]。但由于連作障礙等原因，地黃的栽培品種退化嚴(yán)重，次生代謝產(chǎn)物含量也不穩(wěn)定，藥材的產(chǎn)量與質(zhì)量得不到保證。因此，利用新技術(shù)手段提高活性產(chǎn)物含量，以及從分子水平探究地黃次生代謝產(chǎn)物合成通路，已成為地黃資源及活性產(chǎn)物的重要研究?jī)?nèi)容和新的發(fā)展方向。

毛狀根(又稱(chēng)發(fā)狀根)是整體植株或某一器官、組織(包括愈傷組織)、單個(gè)細(xì)胞，甚至原生質(zhì)體受到發(fā)根農(nóng)桿菌感染時(shí)產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象，主要是在感染部位或其附近產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——毛狀根[3]。與藥用植物植株相比，毛狀根具有擴(kuò)增迅速、容易培養(yǎng)、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；且正常培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的毛狀根新陳代謝活躍，能合成與原植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[4]，是一種優(yōu)質(zhì)的研究材料，近年來(lái)受到眾多學(xué)者的關(guān)注。目前關(guān)于毛狀根的研究主要集中于其在品種改良、藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)及基因功能研究等方面的應(yīng)用[5-7]。

內(nèi)生真菌存在于健康植株組織內(nèi)部，不會(huì)對(duì)宿主植物造成明顯傷害。最新研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可以通過(guò)定殖于宿主植物根部，并產(chǎn)生分泌物來(lái)改善長(zhǎng)期單一栽培土壤中的碳代謝和根際細(xì)菌群落，從而起到一定減輕土壤病的作用[8]，這為內(nèi)生真菌的應(yīng)用研究提供了新的思路。地黃內(nèi)生真菌GG22為河南省道地藥材生態(tài)種植課題組前期從地黃塊根中分離篩選出的內(nèi)生真菌，屬于鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，將內(nèi)生真菌GG22與地黃組培苗共培養(yǎng)后，會(huì)促進(jìn)地黃組培苗的生長(zhǎng)、顯著增加次生代謝產(chǎn)物含量[10]。生物誘導(dǎo)子是指來(lái)源于微生物或動(dòng)植物細(xì)胞的化合物，主要包括病原菌(真菌、細(xì)菌、病毒與酵母提取物)和細(xì)胞壁的分離物[11]，目前應(yīng)用最廣、研究最多的是真菌類(lèi)誘導(dǎo)子。有研究表明，真菌誘導(dǎo)子可通過(guò)誘導(dǎo)毛狀根中某些基因表達(dá)量的變化[12]從而調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中相關(guān)酶的活性, 最終誘導(dǎo)特定次生代謝產(chǎn)物的生成和積累[13-14]，且內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子也能夠?qū)γ珷罡纳L(zhǎng)起到一定的促進(jìn)作用[15-16]。但關(guān)于地黃內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根作用的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以地黃毛狀根為材料，通過(guò)添加不同濃度的內(nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子溶液，研究其對(duì)地黃毛狀根生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物含量的影響，旨在為后期將內(nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子用于工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

地黃促生內(nèi)生真菌GG22菌株由河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)科組培實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)篩選后保存于4℃冰箱。地黃毛狀根，由組織培養(yǎng)室前期誘導(dǎo)所得，培養(yǎng)于1/2 MS固體培養(yǎng)基中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)子溶液的制備及多糖濃度的測(cè)定 將地黃內(nèi)生真菌GG22接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基上活化3 d后，轉(zhuǎn)移至PDA液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)3～4 d。取1 mL菌液接種至新的PDA液體培養(yǎng)基中，120 r·min-1、28℃搖床振搖培養(yǎng)2 d得到種子液[17]。抽濾收集GG22菌絲，用蒸餾水沖洗干凈后研磨成泥狀。稱(chēng)取研磨好的菌絲10 g置于150 mL錐形瓶中，加入蒸餾水，超聲處理1 h，121℃高溫滅菌30 min，離心所得上清液即為誘導(dǎo)子溶液[18]。

采用硫酸-苯酚法以無(wú)水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定誘導(dǎo)子溶液中多糖的濃度，標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置濃度如表1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制Table 1 Preparation of standard solution

精密稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶解后定容于100 mL錐形瓶中，搖勻，配置成標(biāo)準(zhǔn)品溶液。根據(jù)表1加入顯色劑，搖勻后放置室溫顯色20 min。以不加多糖溶液的空白組為參比，在485 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以葡萄糖含量X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=10.214 0X-0.000 7,R2=0.999 4。

誘導(dǎo)子多糖濃度的測(cè)定：取0.1 mL稀釋10倍的誘導(dǎo)子溶液于具塞試管中，加入新配置的9%苯酚溶液1 mL及濃硫酸5 mL。搖勻后放置在室溫下顯色20 min，在485 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度平均值為0.51。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算得誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為500 mg·L-1。

1.2.2 地黃毛狀根的培養(yǎng)及誘導(dǎo)處理 精密稱(chēng)取在1/2 MS固體培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)[19]的地黃毛狀根0.1 g，放入60 mL 1/2MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)23 d后，將誘導(dǎo)子溶液加入液體培養(yǎng)基中，使液體培養(yǎng)基中多糖濃度分別為10、30、50和100 mg·L-1；以加入蒸餾水的處理組為對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別培養(yǎng)0、3、5、8、11 d后取樣，洗凈殘留液體培養(yǎng)基，吸干多余水分，稱(chēng)取鮮重。50℃烘至恒重后稱(chēng)取干重。

1.2.3 總環(huán)烯醚萜苷含量測(cè)定 供試品溶液的制備參照曾令峰等[20]的方法。顯色條件：取供試液1 mL于10 mL具塞試管中，加入70%乙醇1 mL。加入1 mol·L-1的鹽酸溶液2 mL，搖勻，90℃水浴反應(yīng)15 min，放冷。加二硝基苯肼乙醇試液0.5 mL搖勻，90℃水浴反應(yīng)25 min，放冷。加入70%乙醇配置的3 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉，搖勻，室溫下放置1 h。以等量的70%乙醇溶液為空白組，在463 nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.4 毛蕊花糖苷含量測(cè)定 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版一部)[1]地黃項(xiàng)下含量測(cè)定方法。采用1260型高效液相色譜儀(Agilent Technologies Inc., 美國(guó))分析地黃毛狀根中毛蕊花糖苷的含量在內(nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子作用下的變化。色譜條件為：色譜柱：Aichrombond-AQ C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：乙腈∶0.1%醋酸溶液(16∶84，v/v)；檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用Duncan新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 變異系數(shù)權(quán)重法分析誘導(dǎo)子溶液對(duì)地黃毛狀根的促生效果 具體計(jì)算步驟如下：

根據(jù)以上公式求得鮮重、干重、毛蕊花糖苷含量、總環(huán)烯醚萜苷含量的權(quán)重系數(shù)分別為0.182、0.169、0.214、0.435。將計(jì)算得到的權(quán)重系數(shù)帶入，可得到以下公式，用以計(jì)算不同濃度誘導(dǎo)子溶液對(duì)地黃毛狀根促生作用的綜合得分：

F=0.182X鮮重+0.169X干重+0.214X毛蕊花糖苷+0.435X總環(huán)烯醚萜苷

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株GG22誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根生物量的影響

如圖1所示，對(duì)照組地黃毛狀根的生物量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，在第11天達(dá)到最高值。GG22誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為10 mg·L-1時(shí)，地黃毛狀根生物量相比相同培養(yǎng)時(shí)間下的對(duì)照組均有提高，且隨著共培養(yǎng)天數(shù)的增加，地黃毛狀根生物量也不斷增加并在第11天達(dá)到最高，此時(shí)地黃毛狀根鮮重是相同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)照組的1.47倍，干重是相同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)照組的1.32倍。誘導(dǎo)子溶液多糖濃度為30 mg·L-1時(shí)，地黃毛狀根生物量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，在第5天最高。誘導(dǎo)子溶液多糖濃度為50 mg·L-1時(shí)，地黃毛狀根在第3、第8和第11天的生物量高于對(duì)照組；但在第5天時(shí)毛狀根干重相較對(duì)照組無(wú)明顯變化，鮮重較對(duì)照組略微降低。誘導(dǎo)子溶液多糖濃度為100 mg·L-1時(shí)，自第3天起試驗(yàn)組毛狀根的生物量始終高于對(duì)照組，其干重隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈遞增趨勢(shì)，11 d達(dá)最大值；鮮重的變化趨勢(shì)與多糖濃度為50 mg·L-1的試驗(yàn)組一致。

圖1 GG22誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根生物量的影響Fig.1 Effect of GG22 elicitor on biomass of hairy roots of Rehmannia glutinosa

2.2 菌株GG22誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根總環(huán)烯醚萜苷含量的影響

如圖2所示，不同濃度的GG22誘導(dǎo)子溶液對(duì)地黃毛狀根中總環(huán)烯醚萜苷含量的積累均表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。對(duì)照組中總環(huán)烯醚萜苷的含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加逐漸增加。誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為100 mg·L-1時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在第3、第5和第8天時(shí)總環(huán)烯醚萜苷含量更高且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，但在第11天時(shí)總環(huán)烯醚萜苷含量較對(duì)照組略微降低。誘導(dǎo)子溶液濃度為10 mg·L-1及50 mg·L-1時(shí)，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加試驗(yàn)組總環(huán)烯醚萜苷含量逐步積累，在第11天時(shí)含量達(dá)到最高；誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為10 mg·L-1在第11天時(shí)總環(huán)烯醚萜苷含量為相同培養(yǎng)天數(shù)下對(duì)照組含量的1.5倍。誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為30 mg·L-1時(shí)，在第3和第5天總環(huán)烯醚萜苷含量變化不明顯，但在第0～第3天有快速積累，且在第5天后也有快速積累，并在第11天時(shí)含量達(dá)到最高，在誘導(dǎo)子多糖濃度為30 mg·mL-1時(shí)，第11天總環(huán)烯醚萜苷的含量與對(duì)照組差異顯著，較對(duì)照組增加約89%。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: * means significant difference at 0.05 level. The same as following.圖2 GG22誘導(dǎo)子對(duì)毛狀根中總環(huán)烯醚萜苷含量的影響Fig.2 Effect of GG22 elicitor on the contents of total iridoid glycosides in hairy roots

2.3 菌株GG22誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根毛蕊花糖苷含量的影響

對(duì)照組毛蕊花糖苷的含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(shì)，而試驗(yàn)組的毛蕊花糖苷含量的變化趨勢(shì)與空白對(duì)照組不同，且不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根中毛蕊花糖苷含量的積累有不同的影響。在共培養(yǎng)第3天時(shí)，誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為10、50和100 mg·L-1的試驗(yàn)組的毛狀根中毛蕊花糖苷含量比對(duì)照組高，且誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為50 mg·L-1的試驗(yàn)組在培養(yǎng)第3天時(shí)毛蕊花糖苷含量最高，與對(duì)照組具有顯著性差異，是對(duì)照組含量的1.5倍，而誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為30 mg·L-1時(shí)試驗(yàn)組的毛蕊花糖苷含量略低于對(duì)照組。誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為100 mg·L-1的試驗(yàn)組隨著共培養(yǎng)天數(shù)的增加，毛蕊花糖苷的含量沒(méi)有顯著變化，與第0天相比，在共培養(yǎng)第3天其含量略有提高，隨后略微下降并保持穩(wěn)定。

圖3 GG22誘導(dǎo)子對(duì)毛狀根中毛蕊花糖苷含量的影響Fig.3 Effect of GG22 elicitor on the contents of verbascoside in hairy roots

2.4 不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根促生效果比較分析

本試驗(yàn)通過(guò)綜合評(píng)分評(píng)價(jià)不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根的促生效果[21]。權(quán)重系數(shù)是綜合評(píng)價(jià)的關(guān)鍵[22]，以評(píng)價(jià)指標(biāo)變異系數(shù)計(jì)算其權(quán)重系數(shù)，評(píng)價(jià)指標(biāo)的變異系數(shù)越大，所賦的權(quán)重越大[23]。通過(guò)計(jì)算得到總環(huán)烯醚萜苷含量的權(quán)重系數(shù)最高為0.435，可知總環(huán)烯醚萜苷的含量在不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根促生作用的評(píng)價(jià)中具有重要意義。

綜合得分結(jié)果顯示(表2)，加入誘導(dǎo)子的試驗(yàn)組的綜合得分均比對(duì)照組高，表明內(nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根的生物量及次生代謝產(chǎn)物含量有一定的促進(jìn)作用，且以誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為50 mg·L-1，共培養(yǎng)11 d為最優(yōu)誘導(dǎo)條件；誘導(dǎo)子溶液的多糖濃度為100 mg·L-1，共培養(yǎng)11天的試驗(yàn)組較優(yōu)。

表2 不同濃度誘導(dǎo)子溶液對(duì)地黃毛狀根促生作用綜合得分Table 2 Comprehensive score of different concentrations of elicitor solution on promoting growth of R. glutinosa hairy root

3 討論

3.1 地黃內(nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響

根據(jù)性質(zhì)不同可將誘導(dǎo)子分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子兩類(lèi)，而在生物誘導(dǎo)子中應(yīng)用最廣、研究最多的是真菌誘導(dǎo)子[24]。王瑜等[25]研究表明酵母提取物對(duì)王不留行毛狀根的生長(zhǎng)影響作用不明顯，但能明顯促進(jìn)王不留行黃酮苷的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)GG22誘導(dǎo)子溶液對(duì)地黃毛狀根的生物量及次生代謝產(chǎn)物含量有一定影響，一般表現(xiàn)為促進(jìn)作用。在毛蕊花糖苷的含量的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組毛蕊花糖苷含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，推測(cè)可能為毛狀根中的毛蕊花糖苷隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，從毛狀根浸出到液體培養(yǎng)基中。前人研究也發(fā)現(xiàn)在毛狀根培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液中存在次生代謝產(chǎn)物的積累[26]，后續(xù)需要進(jìn)一步對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行分析。在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)高效液相色譜儀檢測(cè)的幾組供試品中未出現(xiàn)與梓醇標(biāo)準(zhǔn)品相同保留時(shí)間的色譜峰。Piatczak等[27]分析地黃毛狀根中有效成分的含量時(shí)，使用質(zhì)譜法檢測(cè)到了梓醇的存在。這可能是由于檢測(cè)器不靈敏或梓醇含量過(guò)少；也可能是地黃毛狀根在內(nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子的作用下促進(jìn)了一些特定酶的表達(dá)，使毛狀根中總環(huán)烯醚萜苷更多轉(zhuǎn)化為其他環(huán)烯醚萜苷類(lèi)物質(zhì)，較少轉(zhuǎn)化為梓醇。

3.2 地黃毛狀根與真菌誘導(dǎo)子共培養(yǎng)的培養(yǎng)條件的優(yōu)化選擇

齊香君等[28]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉誘導(dǎo)子在培養(yǎng)液中質(zhì)量濃度為40 mg·L-1時(shí)，黃芩苷的含量最高，但隨著培養(yǎng)液質(zhì)量濃度的增加，對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)呈抑制狀態(tài)。但明乾良[18]研究發(fā)現(xiàn)丹參毛狀根對(duì)D16誘導(dǎo)子溶液有一個(gè)短暫的適應(yīng)期，在適應(yīng)期內(nèi)高濃度誘導(dǎo)子溶液表現(xiàn)出一定的抑制作用，在適應(yīng)期后則表現(xiàn)出對(duì)丹參毛狀根生物量的促進(jìn)作用。由此可見(jiàn)，隨著濃度和共培養(yǎng)天數(shù)的增加，部分真菌誘導(dǎo)子并不表現(xiàn)出特定的誘導(dǎo)規(guī)律，真菌誘導(dǎo)子能夠起到促進(jìn)作用所需的濃度根據(jù)內(nèi)生真菌種類(lèi)及毛狀根種類(lèi)的不同而有所變化[29-30]，因此需要通過(guò)進(jìn)一步的研究來(lái)確定某一種真菌誘導(dǎo)子最適的濃度及培養(yǎng)天數(shù)。本試驗(yàn)通過(guò)變異系數(shù)權(quán)重法來(lái)分析不同多糖濃度的內(nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子溶液在誘導(dǎo)不同的時(shí)間后對(duì)地黃毛狀根的作用效果。發(fā)現(xiàn)使用多糖濃度為50 mg·L-1的地黃內(nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子，共培養(yǎng)11 d 時(shí)對(duì)于地黃毛狀根的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物積累的促進(jìn)效果最好。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以地黃毛狀根為試驗(yàn)材料，通過(guò)制備GG22菌絲水溶性提取物作為誘導(dǎo)子的方法，研究不同GG22誘導(dǎo)子溶液多糖濃度在不同誘導(dǎo)天數(shù)下對(duì)地黃毛狀根生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明，加入誘導(dǎo)子溶液對(duì)于地黃毛狀根的生物量及總環(huán)烯醚萜苷、毛蕊花糖苷含量的積累有一定的促進(jìn)作用，且通過(guò)變異系數(shù)權(quán)重法分析綜合得分，得出最適宜誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)子多糖濃度為50 mg·L-1，共培養(yǎng)11 d。本研究為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生真菌GG22誘導(dǎo)子對(duì)地黃毛狀根中次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響提供了一定的基礎(chǔ)。