劉 薇，沈 磊，劉改娟，邢龍龍，強(qiáng)亞欣，呂貫廷

(1. 河北省健海生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050035；2. 河北健海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，在腎臟惡性腫瘤中的占比為80～90%，在成人惡性腫瘤中約占2%～3%[1]。臨床研究表明，腎癌的主要治療方法是手術(shù)切除[2]，然而，對(duì)于已經(jīng)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的腎癌患者，極少數(shù)人可以通過(guò)手術(shù)獲得生存期的延長(zhǎng)。據(jù)研究，20%～25%的腎癌患者在疾病早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移后腎癌患者的5年生存率低于10%[3]。雖然目前國(guó)際上已批準(zhǔn)的腎癌治療藥物多達(dá)十余種，但這些藥物對(duì)轉(zhuǎn)移性腎癌的治療效果均十分有限，且易產(chǎn)生耐藥性，治療效果不佳。因此，研發(fā)針對(duì)腎癌的新型特異性藥物是一項(xiàng)十分緊迫并具重大意義的任務(wù)。

SPOP蛋白作為E3泛素連接酶cullin3的接頭分子，組成的E3泛素連接酶復(fù)合體，在很多蛋白的泛素化以及降解的過(guò)程中起重要作用[4]。2009 年Liu J等發(fā)表在Science上的論文指出，在99%的透明細(xì)胞腎癌的腫瘤組織中，SPOP均過(guò)表達(dá)[5]，而在正常腎組織中SPOP的表達(dá)很低，并且在轉(zhuǎn)移性腎癌中SPOP同樣過(guò)表達(dá)。研究人員在對(duì)SPOP的作用機(jī)制進(jìn)一步研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)中的SPOP可以與抑癌因子PTEN 和ERK 磷酸酶DUSP7結(jié)合，之后通過(guò)泛素化通路使抑癌因子降解，進(jìn)而激活PI3K-Akt和ERK腫瘤信號(hào)通路[6]。此外，腎癌組織中的SPOP還可以通過(guò)降解Daxx和Gli2來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。相對(duì)應(yīng)的，敲除SPOP基因可以顯著抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。以上結(jié)論表明，SPOP可以作為透明細(xì)胞腎癌的生物標(biāo)志分子用于診斷或者疾病治療。

因此，本研究將SPOP蛋白作為潛在的藥物靶標(biāo)展開(kāi)研究，以小分子寡肽為研究對(duì)象，應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)研究其對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖抑制作用，以期獲得新的抗腎癌藥物研究方向，為建立抗腫瘤藥物的篩選方案打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及主要試劑

786-O細(xì)胞與Hek293細(xì)胞株：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù);細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI 1640培養(yǎng)基(ThermoFisher )、胎牛血清(Gibco );質(zhì)粒提取試劑盒：無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(天根);轉(zhuǎn)染試劑：TransIntroTM PL Transfection Reagent(全式金TransGen Biotech);MTT法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒：MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit(碧云天Beyotime)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

BioFlash全自動(dòng)酶聯(lián)免疫掃描儀(Werfen，西班牙)，生物安全柜(Thermo Scientifc 1300，美國(guó))，高速臺(tái)式離心機(jī)(ThermoFisher)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma，美國(guó))，微量移液器(eppendorf，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 SBC寡肽編碼基因序列的設(shè)計(jì)及質(zhì)粒載體基因合成

利用計(jì)算機(jī)程序分析SPOP(MATH)結(jié)構(gòu)，確定SPOP(MATH)蛋白表面的一些特異疏水性位點(diǎn)，隨后用計(jì)算機(jī)程序模擬可能和SPOP(MATH)熱點(diǎn)位置結(jié)合的小分子多肽，完成SPOP寡肽分子的虛擬篩選：標(biāo)記為SBC01-SBC08。

1.2.2轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取

根據(jù)模擬SBC的氨基酸序列，轉(zhuǎn)換成核酸序列，選擇pcDNA 3.1載體，提交基因合成公司，構(gòu)建SBC真核表達(dá)載體。

取50 μL的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，分別加入適量的SBC01-SBC08質(zhì)粒(體積不超過(guò)4μL)，冰浴30 min 后，于水浴鍋中42℃熱激活90 s，馬上放冰浴2 min；加入400μL LB培養(yǎng)基，于37℃搖床中振蕩搖培45-60 min；分別取50-100 μL 涂布在含有氨芐青霉素(100μg/mL)的 LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

挑取8種質(zhì)粒的單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基中，再次37℃搖培過(guò)夜后，分別收集菌體，使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行SBC01-SBC08 8種質(zhì)粒的分別提取，提取操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：腎癌細(xì)胞786-O及對(duì)照Hek293細(xì)胞，使用10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞在5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況2-3 d換液一次，細(xì)胞融合度達(dá)到90%后，進(jìn)行傳代或者其他后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在6孔培養(yǎng)板中，每孔接種4-5×105個(gè)細(xì)胞，設(shè)置9個(gè)培養(yǎng)孔，培養(yǎng)24h后，細(xì)胞融合度達(dá)到大約70%，分別轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒及pcDNA3.1(+)-SBC組，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明操作。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及MTT法測(cè)細(xì)胞增殖

(1)克隆形成實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染后24 h，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)，2 d后用瑞吉氏染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色拍照，A液染色1 min，在A液的基礎(chǔ)上，再加B液染色5 min，用純水沖洗染液后，顯微鏡拍照。

(2)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：轉(zhuǎn)染后24 h，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每個(gè)轉(zhuǎn)染組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72 h后每孔加入MTT溶液20 μL ，4 h后吸去 MTT，加入 DMSO溶液200 μL，以溶解甲臜結(jié)晶，30 min后用酶標(biāo)儀在A570nm測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.5 Western Blot測(cè)定蛋白表達(dá)

將上述步驟中效果最佳的SBC寡肽轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后離心收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用Western Blot法測(cè)定細(xì)胞中SPOP、PTEN、DAXX三種蛋白的表達(dá)水平差異。

2 結(jié)果

2.1 SBC序列

根據(jù)計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)的SBC寡肽的氨基酸序列，轉(zhuǎn)換成核酸序列如表1所示，利用基因合成技術(shù)插入到pcDNA3.1-eGFP載體上，用于寡肽的真核表達(dá)。

表1 SBC序列

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

細(xì)胞轉(zhuǎn)染SBC質(zhì)粒后，經(jīng)過(guò)細(xì)胞爬片、固定、通透等步驟后，可在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)情況，細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞克隆染色結(jié)果

2.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及MTT法測(cè)細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染24h后，取出細(xì)胞片，染色后的結(jié)果如表2所示，轉(zhuǎn)染SBC-04和SBC-06多肽的細(xì)胞較其他組細(xì)胞克隆數(shù)明顯較少，即SBC-04和SBC-06的抑制效果相對(duì)較強(qiáng)。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，OD值越高代表細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)狀態(tài)越好，表3和圖1展示了8組多肽轉(zhuǎn)染后的MTT測(cè)定結(jié)果。其中SBC-04組測(cè)得的OD值最低，即該組細(xì)胞增殖最慢。

表3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

圖1 MTT細(xì)胞活力檢測(cè)

2.4 Western Blot結(jié)果

收集轉(zhuǎn)染SBC-04和SBC-06寡肽后的細(xì)胞，進(jìn)行了Western Blot實(shí)驗(yàn)，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)SPOP、PTEN及DAXX的表達(dá)變化，如圖2所示，SPOP蛋白表達(dá)減弱，而SPOP作用的下游蛋白PTEN、DAXX相對(duì)表達(dá)增加，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用增強(qiáng)，與細(xì)胞增殖結(jié)果相符合。

圖2 Western Blot結(jié)果

3 討論

近年來(lái), 關(guān)于蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制劑研究已經(jīng)成為藥物學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)，已有多種蛋白-蛋白相互作用小分子抑制劑(small molecular protein-protein interaction in-hibitors, 簡(jiǎn)稱 SMPIIs)得以報(bào)道[7]。例如：P53-MDM2相互作用小分子抑制劑[8]、作用于Bcl家族的小分子抑制劑等[9]。國(guó)內(nèi)外研究表明，透明腎癌細(xì)胞的不正常增殖與 SPOP 蛋白的高表達(dá)存在一定的相關(guān)性和必然性。SPOP可通過(guò)泛素化和降解多種腎癌中的抑癌基因PTEN、ERK磷酸酶 DUSP7，凋亡分子Dax以及Hh信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子G[10]。有研究顯示，敲除SPOP可以抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡[11-13]，因此我們根據(jù)SPOP的MATH結(jié)構(gòu)域的特征，合成了特異性結(jié)合的寡肽，從而通過(guò)寡肽與SPOP的結(jié)合來(lái)競(jìng)爭(zhēng)性抑制其與底物蛋白質(zhì)的結(jié)合，以干預(yù)SPOP介導(dǎo)的調(diào)控PTEN、DUSP7等抑癌蛋白的泛素化修飾，進(jìn)而抑制腎癌細(xì)胞在體內(nèi)外的生長(zhǎng)。

在以上設(shè)計(jì)思路下，篩選了8種寡肽分子來(lái)研究其抑制透明腎癌細(xì)胞系正常生長(zhǎng)的效果，評(píng)估出SBC-04具有最佳抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的效果，驗(yàn)證了利用計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析進(jìn)而獲得抗腫瘤小分子寡肽技術(shù)路線的可行性。在后期的實(shí)驗(yàn)研究中，計(jì)劃進(jìn)一步研究并觀察其在動(dòng)物模型體內(nèi)的的抑癌效果，同時(shí)開(kāi)展橫向擴(kuò)展腎癌細(xì)胞種類，縱向確定寡肽的作用機(jī)制的研究，并繼續(xù)以目前的寡肽為核心，進(jìn)行分子的結(jié)構(gòu)改造，引入一些增效基團(tuán)，以獲得更有效的抑癌效果，為寡肽分子作為藥物的理論研究做好進(jìn)一步的技術(shù)研究基礎(chǔ)。