金得芳，司馬李杰，劉新福

(南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，附屬邵陽(yáng)醫(yī)院,湖南 邵陽(yáng)，422000)

肺癌是全球發(fā)病率及致死率均較高的惡性腫瘤，每年約有220萬(wàn)新發(fā)病例和179萬(wàn)人死亡[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有病例的85%，主要由腺癌(adenocarcinoma,ADC)和鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma,SQCC)組成。近年來(lái)，由于肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌治療方案和預(yù)后的不同[2]，需準(zhǔn)確區(qū)分肺癌的具體組織病理類型。對(duì)于大多數(shù)能進(jìn)行手術(shù)切除的病例，經(jīng)單獨(dú)的蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining，HE)就能夠正確診斷。然而，在臨床工作中，因NSCLC發(fā)病比較隱匿,大部分患者在就診時(shí)已處于疾病晚期，失去了根治性手術(shù)切除的機(jī)會(huì)[3]。其確診只能依靠活檢標(biāo)本, 但由于標(biāo)本組織量較少,30%～50%的NSCLC病例不能依靠組織病理學(xué)進(jìn)行準(zhǔn)確分型[4]。對(duì)此，WHO提出，免疫組織化學(xué)對(duì)肺癌組織的分型診斷具有積極意義，特別是在小型活檢標(biāo)本中[5]。目前，腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)也能夠?yàn)槊鞔_腫瘤的診斷及分型提供有價(jià)值的參考[6]。為探討常用的免疫組織化學(xué)指標(biāo)聯(lián)合血清腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究選取本院收診的100例晚期NSCLC患者進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年4月至2020年4月在邵陽(yáng)市中心醫(yī)院確診的100例晚期非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料，其中男61例，女39例，年齡35～82(63.31±9.29)歲。病理類型：腺癌44例，鱗癌56例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組前3個(gè)月內(nèi)，未接受過(guò)放化療、免疫靶向治療。(2)通過(guò)CT或B超引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢或在支氣管鏡下取活檢等方法獲得確切的病理結(jié)果。(3)按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版肺癌TNM分期，均屬于不可手術(shù)的Ⅲb期或Ⅳ期。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)并發(fā)≥2種原發(fā)性腫瘤者;(2)合并肺結(jié)核、肺炎等其他肺部疾病者。所有入組患者對(duì)本次研究均已簽署書(shū)面知情同意書(shū),并經(jīng)邵陽(yáng)市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色方法

活檢標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定、梯度酒精(由低→高)脫水、浸蠟包埋、石蠟切片機(jī)(購(gòu)自德國(guó)Leica公司)連續(xù)切片(厚約4 μm)后，一部分切片用于HE染色。余下用于免疫組化染色。采用SP法檢測(cè)肺癌組織中Napsin A和p63的表達(dá)[7]的具體步驟為：脫蠟至水→抗原酸修復(fù)→加入阻斷劑→滴加一抗→滴加二抗→滴加DAB顯色劑→蘇木素復(fù)染，分化反藍(lán)→脫水、封片、拍照記錄。

1.2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

由邵陽(yáng)市中心醫(yī)院2名或2名以上病理科醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，對(duì)于有分歧的診斷，通過(guò)討論得出一致結(jié)論。p63主要表達(dá)于胞核，Napsin A主要表達(dá)于胞質(zhì)。采用著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行綜合判斷。著色強(qiáng)度：無(wú)色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；黃褐色，3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：陰性，0分；≤10%，1分；11%～50%，2分；51%～80%，3分；>80%，4分。陽(yáng)性：著色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分≥4，余陰性。

1.2.3 血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)

抽取患者的空腹外周靜脈血5 mL，混勻后以3 500 r/min離心3 min，取上半層血清送檢。4項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物水平的檢測(cè)采用流式熒光發(fā)光法進(jìn)行，各項(xiàng)指標(biāo)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：CEA>5.0 ng/mL，CA125>35.0 U/mL，NSE>25.0 ng/mL及CYFRA21-1>5.0 ng/mL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 26.0，4項(xiàng)血清腫瘤標(biāo)志物經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，提示均不服從正態(tài)分布，用中位數(shù)M(P50)和四分位間距[M(P25,P75)]進(jìn)行描述，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率進(jìn)行描述。采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)計(jì)算曲線下面積(AUC)，分析聯(lián)合診斷價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理診斷

經(jīng)病理學(xué)診斷后，100例肺癌患者中腺癌44例，鱗癌56例。HE染色結(jié)果顯示：1)腺癌，在病變組織中顯示出乳頭狀、腺泡狀或管狀等呈腺樣分化的結(jié)構(gòu)(圖1A)。2)鱗癌，在病變組織中出現(xiàn)角化現(xiàn)象及細(xì)胞間橋(圖1B)。

2.2 肺癌組織中Napsin A和p63蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：Napsin A陽(yáng)性信號(hào)主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖1C和圖1D)，p63陽(yáng)性信號(hào)主要在細(xì)胞核中表達(dá)(圖1E和圖1F)。

圖1 HE染色(×100)和免疫組織化學(xué)染色圖片(SP×100)Fig.1 HE staining (×100) and immunohistochemical staining(SP×100)

2.3 不同病理分型肺癌患者血清腫瘤標(biāo)志物水平比較

腺癌患者血清CEA水平高于鱗癌者水平(P<0.05)，CYFRA21-1水平低于鱗癌者(P<0.05)，兩者的血清CA125及NSE水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同病理分型肺癌血清腫瘤標(biāo)志物水平比較Table 1 Comparison of serum tumor markers in different pathological types of lung cancer [M(P25,P75)]

2.4 Napsin A，p63，CEA及CYFRA21-1診斷NSCLC價(jià)值分析

聯(lián)合檢測(cè)中除特異度略有下降外，其余指標(biāo)均高于單項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果。見(jiàn)表2。

表2 Napsin A，p63，CEA及CYFRA21-1診斷NSCLC價(jià)值分析Table 2 Analysis of the value of Napsin A, p63, CEA and CYFRA21-1 in the diagnosis of NSCLC

2.5 聯(lián)合診斷價(jià)值分析

Napsin A和CEA聯(lián)合診斷腺癌的AUC(0.926)高于各項(xiàng)單獨(dú)診斷，且p63和血清CYFRA21-1聯(lián)合診斷鱗癌的AUC(0.852)也高于各項(xiàng)單獨(dú)診斷的AUC，表明兩者聯(lián)用的診斷價(jià)值均優(yōu)于各項(xiàng)的單獨(dú)使用價(jià)值，與病理結(jié)果一致性較高。見(jiàn)表3。

表3 聯(lián)合診斷價(jià)值Table 3 Combined diagnostic value

3 討論

肺腺癌和鱗癌的治療方案不同，預(yù)后也有差異。近年來(lái)，以EGFR，ALK及MET等靶點(diǎn)為代表的分子靶向藥物的使用，在很大程度上改善了患者的生存及預(yù)后，現(xiàn)已成為驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性的肺腺癌的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案[8]。但肺鱗癌因缺乏有效的分子靶向藥物，其一線治療主要采用含鉑雙藥化療[9]，其生存率比肺腺癌的生存率低[2]。因此，準(zhǔn)確區(qū)分NSCLC的組織病理類型至關(guān)重要，關(guān)系到治療方案的選擇。

血清腫瘤標(biāo)志物是指癌細(xì)胞在癌癥發(fā)生、增殖過(guò)程中合成、分泌或機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞反應(yīng)所產(chǎn)生的一類物質(zhì)，其表達(dá)水平與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、消退和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[6]。CEA在乳腺癌、肺癌等腫瘤中可顯著升高,但在吸煙者和部分良性疾病(如肝硬化、肺氣腫及結(jié)腸炎)的患者中也會(huì)不同程度地升高[10]，因此，其在肺癌的診斷上沒(méi)有較高的特異性。CA125屬黏液型糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量較高，由MUC16基因編碼產(chǎn)生，MUC16可在呼吸道、胃腸道等多種組織中表達(dá)[11]。NSE是一類內(nèi)分泌組織或神經(jīng)組織所特有的酶類抗原，其血清含量在神經(jīng)內(nèi)分泌組織來(lái)源的癌癥如小細(xì)胞肺癌等中較高，也可在肺腺癌等患者血清中表達(dá)[12]。CYFRA21-1為角蛋白類抗原，多于肺泡上皮組織中表達(dá)，有研究表明，在各種類型的肺癌患者中血清CYFRA21-1均可升高，尤其見(jiàn)于肺鱗癌，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否和疾病分期有關(guān)[12]。在本次研究中，血清CEA，CYFRA21-1水平在肺腺癌及鱗癌中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，部分血清腫瘤標(biāo)志物能對(duì)肺癌的病理分型進(jìn)行初步判斷。

腫瘤標(biāo)志物雖對(duì)肺癌的診斷有一定的參考價(jià)值，但容易受到其他因素的影響，造成假陽(yáng)性或假陰性，影響臨床對(duì)病理分型的判斷?，F(xiàn)雖采用多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)法，但亦未能避免這種局限性[13]。因此，為提高分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議采用多種手段進(jìn)行分析，避免因誤診、漏診而引起醫(yī)療事故及糾紛的發(fā)生。目前，臨床上對(duì)肺癌組織進(jìn)行病理分型的另一重要手段是免疫組織化學(xué)法。

Napsin A是一種天門冬氨酸水解蛋白酶，可顯著表達(dá)于人類的腎臟及肺，現(xiàn)已為肺腺癌診斷中最常用的免疫標(biāo)志物。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Napsin A對(duì)診斷肺腺癌的敏感度為83.0%～90.0%，特異度為90.0%～98.0%[14]。在本研究中，Napsin A對(duì)肺腺癌診斷的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度分別為84.1%，96.4%及90.0%，數(shù)據(jù)表明，Napsin A對(duì)肺腺癌的診斷分型具有較高的價(jià)值。另外，在本研究中Napsin A與血清CEA聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為97.7%，特異度為87.5%，準(zhǔn)確度為92.0%，診斷腺癌的AUC為0.926(P<0.001)，除特異度稍有下降外，其余指標(biāo)比各單項(xiàng)檢測(cè)均要高。因此，聯(lián)合檢測(cè)的價(jià)值更高。

p63作為p53基因家族的新成員，通常在有鱗狀上皮分化能力的細(xì)胞(如表皮、泌尿道及宮頸等)中表達(dá)，在肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起獨(dú)特的作用[15]。有研究表明，p63診斷肺鱗癌的敏感度為90.0%～100.0%，特異度為68.0%～96.0%[16]。在本研究中，p63診斷肺鱗癌的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度依次為92.9%，75.0%及85.0%。表明p63對(duì)肺鱗癌的分型診斷具有較高的價(jià)值，在靈敏度及特異度方面，與文獻(xiàn)中的結(jié)果相符。其次，在本研究中，p63與血清CYFRA21-1聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為98.2%，特異度為70.5%，準(zhǔn)確度為86.0%，診斷鱗癌的AUC為0.852(P<0.001)，除特異度略有下降，其余指標(biāo)均高于各單項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果，與病理結(jié)果的一致性較好，提示p63與血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可有效提高診斷肺鱗癌的能力，使診斷結(jié)果盡可能地符合病理診斷結(jié)果。

綜上所述，Napsin A，p63與血清腫瘤標(biāo)志物能為肺癌的分型診斷提供一定的參考，聯(lián)合檢測(cè)可有效提高其分型診斷準(zhǔn)確率。