范立淳，時勇，姜生偉，鄭雅楠＊

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,遼寧 沈陽 110866；2.遼寧省危險性林業(yè)有害生物防控重點(diǎn)實驗室,遼寧 沈陽 113122)

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的病害被稱為松樹的“癌癥”，具有傳播迅速、繁殖力強(qiáng)，致死樹木快的特點(diǎn)，松樹感染松材線蟲病后最快40 天就可死亡，松林感病后3～5 年即可毀滅，松材線蟲是目前我國最為嚴(yán)重的森林有害生物，對我國以林業(yè)為主的生態(tài)環(huán)境建設(shè)造成重大威脅[1]。截止至2020 年，松材線蟲病的疫區(qū)已達(dá)18 省667 個縣（區(qū)）[2]。遼寧省于2018 年被正式確定為松材線蟲病新發(fā)生區(qū)，疫點(diǎn)涉及7 市22 縣[2]，這是我國首次在年均溫度10℃以下的地區(qū)發(fā)現(xiàn)松材線蟲病的危害[3]。松材線蟲病的傳入直接威脅到遼寧省大面積的松林，以及沈陽市東陵和北陵等世界自然文化遺產(chǎn)，各自然保護(hù)區(qū)和風(fēng)景名勝區(qū)的重點(diǎn)生態(tài)區(qū)域的安全，嚴(yán)重影響社會和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

松材線蟲雖然危害嚴(yán)重，但卻不能自行傳播擴(kuò)散，必須借助松褐天牛（Monochamus alternatus）等媒介昆蟲才能傳播蔓延。根據(jù)前人的研究發(fā)現(xiàn)，能夠傳播松材線蟲病的媒介昆蟲種類集中在墨天牛屬[4-16]。目前發(fā)現(xiàn)在我國能攜帶且能成功傳播松材線蟲的媒介昆蟲有兩種：松褐天牛和云杉花墨天牛（Monochamus saltuariusGebler）[4-5]。其中，云杉花墨天牛為遼寧省中溫帶地區(qū)新發(fā)現(xiàn)的特有的松材線蟲病媒介昆蟲[4,6]，主要危害遼寧地區(qū)的紅松（Pinus koraiensisSieb.et Zucc.）、油松（Pinus tabuliformisCarr.）、日本黑松（Pinust hunbergiiParl.）、華山松（Pinus armandiiFranch.）、樟子松（Pinus sylvestrisvar.mongolicaLitv.）、長白落葉松（Larix olgensisHenry）、日本落葉松（Larix kaempferi(Lamb.) Carr.）和華北落葉松（Larix principis-rupprechtii(Mayr) Pilger）[6-9]。而在我國南方疫區(qū)主要媒介昆蟲為松褐天牛，該天牛也是我國分布最廣的松材線蟲病媒介昆蟲[5,10]。目前，關(guān)于遼寧松材線蟲病發(fā)生區(qū)是否存在其他潛在媒介昆蟲種類尚不明確，因此本研究對遼寧松材線蟲病發(fā)生區(qū)攜帶松材線蟲的天牛種類進(jìn)行全面的調(diào)查和研究，旨在進(jìn)一步明確遼寧松材線蟲病發(fā)生區(qū)的傳播媒介，這將對遼寧省防治松材線蟲病有著至關(guān)重要的意義。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查樣地

2018—2019 年，選擇遼寧省4 個松材線蟲病發(fā)生區(qū)，分別為撫順、大連、本溪和丹東作為調(diào)查地點(diǎn)，并設(shè)立調(diào)查樣地，樣地具體的林分情況如表1 所示。

表1 調(diào)查樣地的林分情況Table 1 Stand condition of forest sample plots

1.2 天牛成蟲的調(diào)查

1.2.1 天牛誘捕器調(diào)查 2018 年至2019 年，從5月上旬至9月下旬為天牛羽化期，在林地隨機(jī)懸掛天牛誘捕器（ZM-80B 型誘捕器和APF-I 型媒介天牛高效誘芯），確保每塊樣地的林緣和林間均有懸掛誘捕器，懸掛間隔為50 m，懸掛高度1.5～2.0 m，每個月更換1 次誘芯。每隔7 d 收集誘捕到的天牛，并將誘捕到的天牛樣品帶回實驗室，進(jìn)行鑒定（圖1）。

圖1 天牛誘捕器Fig.1 The traps of long-horned beetles

1.2.2 疫木內(nèi)天牛的調(diào)查 2020 年4月，林地隨機(jī)選取感染松材線蟲病死亡且受天牛危害的疫木，將疫木鋸成1 m 長的木段，兩端封蠟，用鐵絲網(wǎng)幕（8 目鐵網(wǎng)）包裹，防止木段內(nèi)的天牛逃逸。隨后，將木段置于自然條件下，每天觀察并及時收集新羽化的天牛，將收集到的天牛成蟲帶回實驗室，統(tǒng)計數(shù)量（圖2）。

圖2 包網(wǎng)疫木Fig.2 Infected wood wrapped by iron net

1.3 天牛的鑒定

參考《東北天牛志》[17]、《中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志：鞘翅目天?？疲ㄒ唬穂10]、《中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志：鞘翅目天?？疲ǘ穂18]和《中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志：鞘翅目天?？疲ㄈ穂19]等書籍以及其他文獻(xiàn)資料，通過觀察蟲體各部分的形態(tài)學(xué)特征，如：體色、斑紋、體型、體長、鞘翅和頭部等形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

1.4 線蟲的分離與鑒定

1.4.1 線蟲的分離 采用貝曼式漏斗法分離線蟲[20]，將從疫木中初羽化的云杉花墨天?；铙w剪碎，包裹在四層紗布內(nèi)，置于漏斗中并向漏斗內(nèi)注入純凈水，確保蟲體全部浸泡在水中。6 h 后，將浸出液用1 000 r·min?1的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，查數(shù)濃縮液中線蟲數(shù)量并備用。

1.4.2 松材線蟲的鑒定（1）形態(tài)學(xué)鑒定。用100 μL 移液槍挑取線蟲濃縮液中的線蟲成蟲滴至載玻片上，將其置于酒精燈火焰上方加熱3～5 s。線蟲熱殺后呈“J”形，加蓋玻片，制成臨時玻片，在顯微鏡下觀察并鑒定線蟲形態(tài)特征。參考《植物病原線蟲學(xué)》[21]和來燕學(xué)方法[22]，通過在解剖鏡下觀察松材線蟲的體長、頭部、中食道球，性器官，雌蟲尾尖突等形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

（2）基因組學(xué)鑒定。線蟲DNA 提取參考于海英[7]的方法，按照松材線蟲檢測試劑盒（南京生興有害生物防治技術(shù)股份有限公司）要求的步驟提取線蟲 DNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增和檢測。正向引物序列為正向引物序列為5′-GAGCAGAAA CGCCGACTT-3′，反向引物序列為5′-CGTAAA ACAGATGGTGCCTA-3′，TaqMan 探針序列為5′-TGCACGTTGTGACAGTCGT-3′，探針5′端標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)為6-carboxyfluorescein（FAM），3′端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)為 tetramethyl-carboxy-rhodamine（TAMRA）將混合后的溶液放入松材線蟲自動化分子檢測儀（南京生興有害生物防治技術(shù)股份有限公司）自動檢測程序。即95 ℃ 運(yùn)行10 min，循環(huán)程序:95 ℃下運(yùn)行15 s，60 ℃下運(yùn)行35 s，共35個循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

調(diào)查所得數(shù)據(jù)均利用Excel 軟件（Microsoft office 2020）進(jìn)行整理，利用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相同樣品不同處理間的比較采用單因素方差分析（SNK 多重比較法，P≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 遼寧省天牛種類及數(shù)量

調(diào)查結(jié)果顯示，在遼寧松材線蟲病發(fā)生區(qū)共調(diào)查到9 種天牛，分別是云杉花墨天牛、松褐天牛、褐梗天牛（Arhopalus rusticus）、脊鞘幽天牛（Asemum striatum）、松皮花天牛（Rhagium inquisitor）、小灰長角天牛（Acanthocinus griseus）、雙簇污天牛（Moechotypa diphysis）、灰長角天牛（Acanthocinus aedilis）和鉤突土天牛（Dorysthenes sternalis）。其中云杉花墨天牛的誘捕數(shù)量最多，為2 387 頭；其次依次是松褐天牛329 頭、褐梗天牛317 頭、脊鞘幽天牛84 頭、鉤突土天牛41 頭、小灰長角天牛22 頭、松皮花天牛12 頭、灰長角天牛5 頭、雙簇污天牛1 頭，通過查閱《東北天牛志》并根據(jù)林間實際情況，得出9 種天牛的寄主植物（表2）。

表2 遼寧松材線蟲病發(fā)生區(qū)的天牛種類和數(shù)量 Table 2 The species and quantity of long-horned beetles of epidemic area in Liaoning

2.2 遼寧省攜帶松材線蟲天牛種類及數(shù)量

2.2.1 遼寧省攜帶松材線蟲的天牛種類 結(jié)合各個松材線蟲病發(fā)生區(qū)具體情況，在遼寧省不同的松材線蟲病發(fā)生區(qū)攜帶松材線蟲的天牛種類存在差異（圖3）。在撫順、丹東和本溪疫區(qū)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)攜帶松材線蟲的天牛共3 種，分別是云杉花墨天牛、褐梗天牛和脊鞘幽天牛；在大連疫區(qū)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)攜帶松材線蟲的天牛共3 種，分別為松褐天牛、褐梗天牛和脊鞘幽天牛，4 種天牛成蟲形態(tài)見圖4。其中，松褐天牛為大連疫區(qū)特有的體內(nèi)攜帶松材線蟲的天牛；云杉花墨天牛為遼寧省其他疫區(qū)特有的體內(nèi)攜帶松材線蟲的天牛。

圖3 遼寧省攜帶松材線蟲天牛的地理分布Fig.3 Geographical distribution of long-horned beetles carrying Bursaphelenchus xylophilus in Liaoning

圖4 攜帶松材線蟲天牛成蟲Fig.4 Adults of long-horned beetles carrying Bursaphelenchus xylophilus

2.2.2 遼寧省攜帶松材線蟲的天牛數(shù)量 在撫順、丹東和本溪發(fā)生區(qū)，云杉花墨天牛成蟲的誘捕數(shù)量均高于其他兩種天牛的數(shù)量，該天牛的誘捕數(shù)量占相同疫區(qū)內(nèi)的松樹天牛誘捕總量的51%以上，為這幾個地區(qū)的松林內(nèi)數(shù)量最多的天牛種群；在大連疫區(qū)，褐梗天牛的誘捕數(shù)量較高，占天牛誘捕總量的62.43%，為松林內(nèi)數(shù)量最多的天牛種群（圖5）。

圖5 攜帶松材線蟲的天牛總誘捕數(shù)量Fig.5 The number of long-horned beetles carrying Bursaphelenchus xylophilus collected by traps

2.3 遼寧省疫木內(nèi)初羽化的云杉花墨天牛攜帶松材線蟲數(shù)量

對誘捕器內(nèi)收集到的松樹天牛進(jìn)行檢測共發(fā)現(xiàn)4 種124 頭天牛能攜帶松材線蟲，其中褐梗天牛占比最大，為58%，其次依次是云杉花墨天牛35%，松褐天牛6%，脊鞘幽天牛1%（圖6）。雖然褐梗天牛，脊鞘幽天牛能攜帶松材線蟲，但其是否為媒介昆蟲尚未有定論，參考于海英研究確定遼寧省松材線蟲病的主要媒介昆蟲為云杉花墨天牛，大連市疫區(qū)主要媒介昆蟲為松褐天牛[4]。

圖6 攜帶松材線蟲的天牛數(shù)量占比Fig.6 Proportion of different long-horned beetle species carrying Bursaphelenchus xylophilus

通過疫木包網(wǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)云杉花墨天牛成蟲體內(nèi)攜帶松材線蟲的平均數(shù)量為513.69 條·頭?1，其中雌成蟲體內(nèi)攜帶松材線蟲的平均數(shù)量為775.44條·頭?1，最大值為10060 條·頭?1，最小值為1 條·頭?1；雄成蟲體內(nèi)攜帶松材線蟲的平均數(shù)量為191.54條·頭?1，最大值為3620 條·頭?1，最小值為1 條/·頭?1（表3）。

表3 初羽化云杉花墨天牛成蟲攜帶松材線蟲的數(shù)量Table 3 Number of Bursaphelenchus xylophilus carried by newly emerged Monochamus saltuarius adults

3 討論

不同地區(qū)、不同種類的媒介昆蟲體內(nèi)攜帶松材線蟲的數(shù)量均存在一定差異。前人研究發(fā)現(xiàn)北美卡羅萊納墨天牛（Monochamus carolinensis）體內(nèi)攜帶松材線蟲的平均攜帶量均能達(dá)到1.9 萬余條·頭?1[14]，松褐天牛體內(nèi)攜帶松材線蟲的平均攜帶量為1.8 萬條·頭?1[12]，日本云杉花墨天牛攜帶量為9 000條·頭?1[13]。本研究調(diào)查結(jié)果顯示在遼寧省松材線蟲病發(fā)生區(qū)，媒介天牛云杉花墨天牛體內(nèi)攜帶松材線蟲的數(shù)量既少于南方疫區(qū)松褐天牛的攜帶量，也少于日本云杉花墨天牛的攜帶量，然而松材線蟲數(shù)攜帶量較少卻也能夠感染并致死紅松和油松，可能與樹種的抗病性較弱有關(guān)。分析云杉花墨天牛攜帶線蟲量較少可能由于與體型有關(guān)：與松褐天牛相比，云杉花墨天牛體型較小[17]，推測其氣管的容積也相對較小，氣管是媒介天牛攜帶松材線蟲的主要部位[23]，可能是由于云杉花墨天牛氣管容積有限，所以無法攜帶較多的松材線蟲，有關(guān)該天牛氣管結(jié)構(gòu)與容積大小對松材線蟲攜帶與傳播的影響有待進(jìn)一步研究。同時天牛體內(nèi)線蟲攜帶量也可能與松樹體內(nèi)線蟲的數(shù)量與分布有關(guān)，紅松為遼寧特有的松材線蟲病寄主樹種[4]，也是近年來新發(fā)現(xiàn)的中溫帶地區(qū)松材線蟲病自然感病樹種，松材線蟲在病死紅松內(nèi)的發(fā)生數(shù)量和分布情況尚不明確，這些因素也會影響云杉花墨天牛攜帶松材線蟲的數(shù)量。松褐天牛在遼寧松材線蟲病發(fā)生區(qū)只分布在大連地區(qū)，且數(shù)量較少，本研究調(diào)查了誘捕器收集到的松褐天牛體內(nèi)攜帶線蟲數(shù)量，因無法確認(rèn)供試松褐天牛是否通過補(bǔ)充營養(yǎng)的途徑釋放松材線蟲，故其體內(nèi)松材線蟲的攜帶量較少，需要進(jìn)一步調(diào)查初羽化松褐天牛體內(nèi)攜帶松材線蟲數(shù)量。

此外，調(diào)查發(fā)現(xiàn)林間褐梗天牛攜帶松材線蟲比例相對較大，但褐梗天牛是否能夠傳播松材線蟲還未得到證實。為有效控制松材線蟲病在在遼寧省的危害，防止其繼續(xù)向北擴(kuò)散，我們?nèi)孕鑼Γ?）遼寧省松材線蟲病發(fā)生區(qū)內(nèi)潛在媒介昆蟲種類；2）媒介昆蟲在不同寄主松樹上的生活史和危害特點(diǎn)；3）媒介昆蟲在遼寧松材線蟲病發(fā)生區(qū)的生物學(xué)特征和攜帶松材線蟲傳播規(guī)律；4）我國中溫帶地區(qū)褐梗天牛能否傳播松材線蟲等問題展開研究。

4 結(jié)論

遼寧省作為松材線蟲病的新發(fā)生區(qū)，松材線蟲的發(fā)生規(guī)律、寄主植物的種類和媒介昆蟲的種類均與我國其他松材線蟲病疫區(qū)存在較大的差異。通過在林間懸掛誘捕器、包網(wǎng)疫木發(fā)現(xiàn)，遼寧松材線蟲病發(fā)生區(qū)共調(diào)查到9 種松樹天牛，分別為云杉花墨天牛、松褐天牛、褐梗天牛、脊鞘幽天牛、松皮花天牛、小灰長角天牛、雙簇污天牛、灰長角天牛和鉤突土天牛。其中云杉花墨天牛、松褐天牛、褐梗天牛和脊鞘幽天牛體內(nèi)攜帶松材線蟲；明確了云杉花墨天牛和松褐天牛為遼寧省松材線蟲病疫區(qū)的主要媒介昆蟲。通過對松樹天牛體內(nèi)松材線蟲攜帶量的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云杉花墨天牛和松褐天牛體內(nèi)攜帶松材線蟲的數(shù)量較少，而其他天牛體內(nèi)可攜帶大量的松材線蟲，由此推測其他天牛有可能成為遼寧省松材線蟲病疫區(qū)的潛在媒介。