劉詩光， 趙敬坤， 陸愛國， 毛志海

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院外科 上海市微創(chuàng)外科臨床醫(yī)學(xué)中心，上海 200025）

結(jié)腸直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，也是引起病人死亡的主要癌癥之一。在世界范圍內(nèi)，結(jié)腸直腸癌的發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌[1]。在我國，隨著飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的變化，結(jié)腸直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，嚴(yán)重威脅我國人民的健康[2]。一直以來，結(jié)腸直腸癌的治療采取以手術(shù)治療為主，結(jié)合放、化療的模式。近年來，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為主的免疫治療受到廣泛關(guān)注，有望成為針對結(jié)腸直腸癌的一種新型治療方式。免疫治療通過再次激發(fā)機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，抑制腫瘤免疫逃逸，從而激活腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力[3]。趨化因子是腫瘤微環(huán)境中重要的成分之一，是溝通免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵因子[4]。然而，趨化因子與免疫檢查點(diǎn)標(biāo)志物在結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后中的預(yù)測價(jià)值尚未充分闡述。

CXCL5（C-X-C motif ligand 5）又稱上皮中性粒細(xì)胞激活肽78，屬于ELR+CXC趨化因子家族的一員[5]。近年來的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CXCL5在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用。在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中，CXCL5的高表達(dá)與NSCLC的血管生成相關(guān)[6]。Begley等[7]發(fā)現(xiàn)CXCL5在前列腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)升高。此外，CXCL5可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）是B7家族成員之一，又稱 B7-H1、CD274。其與受體PD-1結(jié)合，通過影響DC抗原提呈，或限制T淋巴細(xì)胞的活化和擴(kuò)散，從而在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[8]。本研究主要探討趨化因子CXCL5與PD-L1在聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后中的價(jià)值。

研究對象與方法

一、研究對象

入組78例不同病理分期的結(jié)腸直腸癌病人。收集自2010年至2011年我院外科行腹腔鏡切除病人的腫瘤組織及癌旁正常組織，經(jīng)活檢和術(shù)后病理檢查、明確診斷。不納入急診手術(shù)病人。所有病人術(shù)前未接受任何放、化療及生物治療。組織芯片委托上海芯超生物芯片定制。取自結(jié)腸直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁正常組織，距離腫瘤＞5 cm，后者作為對照。腫瘤的分期依照美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Commission on Cancer,AJCC）的pTNM分期。標(biāo)本的采集通過我院倫理委員會審批。

二、免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色一抗抗體：CXCL5（Mouse,R&D,USA）；PD-L1（Rabbit,Abcam,UK）。 染色詳細(xì)步驟見文獻(xiàn)[9]。組織芯片脫蠟至水后采用H2O2室溫停留10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）沖洗 3 次，每次 3～5 min。 100 μL 正常非免疫動物血清封閉2 h，棄去封閉液后加入一抗，4℃冰箱過夜。PBS沖洗3次，每次3～5 min，加入二抗，室溫 20～30 min。PBS 沖洗 3 次，每次 3～5 min，加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的標(biāo)志物，室溫10 min。PBS沖洗3次，每次3～5 min。滴加DAB顯色，復(fù)染、脫水、封片。

三、免疫組織化學(xué)評分

免疫組織化學(xué)評分采用免疫危險(xiǎn)評分（immune risk score，IRS）標(biāo)準(zhǔn)，由2名病理專業(yè)醫(yī)師在雙盲情況下，對每個點(diǎn)進(jìn)行染色評分。評分的內(nèi)容包括組織化學(xué)染色的強(qiáng)度和陽性染色細(xì)胞所占的百分比。IRS=染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分比。染色強(qiáng)度分為4級，陰性為未見陽性細(xì)胞，0級,弱陽性1級，中等陽性2級,強(qiáng)陽性3級。陽性細(xì)胞百分比分為5級，即 0 級（無染色）、1 級（染色細(xì)胞＜10%）、2 級（10%～50%）、3 級（51%～80%）、4 級（＞80%）。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 8.0、SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用 Pearson χ2檢驗(yàn)分析 CXCL5、PD-L1 與臨床特征之間的關(guān)系。用Kaplan-Meier方法繪制總體生存期曲線，并用對數(shù)秩和檢驗(yàn)檢出兩組間差異。用Cox回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CXCL5、PD-L1在結(jié)腸直腸癌組織與正常組織中表達(dá)的比較

CXCL5與PD-L1免疫組織化學(xué)染色評分最佳cut-off值運(yùn)用X-tile軟件 （版本3.6.1，Yale University School of Medicine,USA）依據(jù)病人的生存期計(jì)算得出。采用X-tile軟件計(jì)算，CXCL5的最佳cutoff值為4.5，PD-L1最佳cut-off值為0.4。 當(dāng) PD-L1為0.4時IRS分值≥4.5為高表達(dá)，IRS分值＜4.5為低表達(dá)（見圖1）。

圖1 基于結(jié)腸直腸癌病人生存數(shù)據(jù)的X-tile分析顯示CXCL5和PD-L1免疫組織化學(xué)染色評分的cut-off值

CXCL5主要表達(dá)于結(jié)腸直腸癌組織的細(xì)胞質(zhì)，其中48例（61.5%）高表達(dá)，30例低表達(dá)。與癌旁正常組織相比，其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（見表1、圖2 A～B）。PD-L1在結(jié)腸直腸癌組織中表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜及浸潤性淋巴細(xì)胞，其中37例（47.4%）高表達(dá)，41例低表達(dá)。在癌旁正常組織中幾乎不表達(dá)，其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（見表 1、圖 2 C～D）。

圖2 免疫組織化學(xué)染色顯示CXCL5與PD-L1在結(jié)腸直腸癌組織中的表達(dá)

二、結(jié)腸直腸癌組織中CXCL5、PD-L1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

結(jié)腸直腸癌組織中CXCL5的表達(dá)，在不同腫瘤直徑、TNM分期間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），不同性別、年齡、組織學(xué)分型間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。同樣，PD-L1的表達(dá)，在不同腫瘤直徑、TNM分期間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而不同性別、年齡、組織學(xué)分型間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。

表1 結(jié)腸直腸癌組織中CXCL5、PD-L1表達(dá)與病人臨床特征的關(guān)系

三、CXCL5、PD-L1在結(jié)腸直腸癌組織中的表達(dá)與病人預(yù)后的相關(guān)性分析

本研究結(jié)腸直腸癌病人5年總生存率為73.1%（57/78），中位生存時間為52（18～60）個月。Cox單因素回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期、CXCL5高表達(dá)、PD-L1高表達(dá)是結(jié)腸直腸癌病人總生存率的 預(yù) 后 危 險(xiǎn) 因 素 （P=0.002、P=0.019、P=0.040）。CXCL5高表達(dá)從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度未能成為獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素（P=0.098），但其P值接近0.05。造成該現(xiàn)象的原因可能是樣本量有限。在將PD-L1納入模型的情況下，TNM分期和PD-L1高表達(dá)成為結(jié)腸直腸癌病人總生存的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素 （P=0.013、P=0.006）。多因素回歸分析顯示，在未將PD-L1納入模型的情況下，TNM分期是結(jié)腸直腸癌病人總生存的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素（P=0.011）。CXCL5高表達(dá)不是獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素（P=0.728）（見表2）。

表2 結(jié)腸直腸癌病人單因素與多因素Cox回歸分析

四、CXCL5、PD-L1高表達(dá)對結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后生存的影響

CXCL5高表達(dá)組5年生存率64.6%（31/48），中位生存時間為50（18～60）個月。CXCL5低表達(dá)組5年生存率86.7%（26/30），顯著高于高表達(dá)組，中位生存時間為53（19～60）個月。運(yùn)用 Kaplan-Meier生存曲線法以及Log-Rank分析結(jié)果顯示CXCL5低表達(dá)組5年生存率顯著高于高表達(dá)組 （86.7%比64.6%，P＜0.05）（見圖 3 A）。表明 CXCL5 表達(dá)與結(jié)腸直腸癌病人不良預(yù)后相關(guān)。

PD-L1高表達(dá)組5年生存率54.1%（20/37），中位生存時間為50（18～60）個月。PD-L1低表達(dá)組5年生存率為90.2%（37/41），中位生存時間為53（32～60）個月。運(yùn)用 Kaplan-Meier生存曲線法及Log-Rank分析，結(jié)果顯示PD-L1低表達(dá)組5年生存率顯著高于高表達(dá)組（92.7%比54.1%，P＜0.05）（見圖3B）。表明PD-L1表達(dá)預(yù)示結(jié)腸直腸癌病人不良預(yù)后。

五、CXCL5及PD-L1聯(lián)合表達(dá)與結(jié)腸直腸癌病人生存期的關(guān)系

依據(jù)CXCL5與PD-L1表達(dá)情況，將78例結(jié)腸直腸癌臨床標(biāo)本分為4組樣本[CXCL5高表達(dá)PDL1高表達(dá)組 （32例）、CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組（16例）、CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組（5例）、CXCL5低表達(dá)PD-L1低表達(dá)組（25例）]（見圖3C）。Kaplan-Meier生存曲線法及 Log-Rank分析結(jié)果顯示，CXCL5高表達(dá)PD-L1高表達(dá)組較另外3組（CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1低表達(dá)組）5年生存率顯著降低（46.9%比100%、80%、87.5%，P＜0.05）。CXCL5高表達(dá)PD-L1高表達(dá)組較CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組預(yù)后差（46.9%比100%，P＜0.05）。CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組5年生存率與CXCL5低表達(dá)PD-L1低表達(dá)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（80%比87.5%，P＞0.05）。 同樣，CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組間的生存率差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（100%比80%，P＞0.05）（見圖 3D）。

討 論

趨化因子是腫瘤外微環(huán)境與腫瘤溝通的橋梁。趨化因子的表達(dá)受多種因素影響。

CXCL5在腫瘤的進(jìn)展、生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用[10-11]。CXCL5基因定位于人4號染色體q13-q21，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，其mRNA全長2 475 bp,開放閱讀框共342個核苷酸，編碼含114個氨基酸的肽鏈[12]。CXCL5與受體CXCR2特異結(jié)合后，可趨化中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的游走、脫顆粒等一系列生物學(xué)效應(yīng),在機(jī)體的抗感染、抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用。CXCL5同時具有促血管生成、介導(dǎo)炎性反應(yīng)及參與結(jié)締組織重塑等重要生物學(xué)功能[13-14]。PD-L1的表達(dá)則有助于構(gòu)建免疫耐受微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[15]。PD-L1除在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表達(dá)外，也表達(dá)于多種類型的腫瘤細(xì)胞表面[16-18]。在結(jié)腸直腸腫瘤中，研究發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白的陽性表達(dá)預(yù)示著不良預(yù)后[19]。然而，也有學(xué)者認(rèn)為結(jié)腸直腸癌病人中PD-L1蛋白的陽性表達(dá)與良好預(yù)后有關(guān)[20]。由此可見，PD-L1高表達(dá)與結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后的關(guān)系尚存爭議，有必要進(jìn)一步研究明確。目前在其他實(shí)體瘤中尚無CXCL5與PD-L1聯(lián)合預(yù)測腫瘤病人預(yù)后的研究，但已有研究證實(shí)CXCL5與PD-L1之間的關(guān)聯(lián)。如小鼠結(jié)腸癌模型中，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可分泌CXCL5促進(jìn)腫瘤表面PD-L1的表達(dá)[21]。本研究探討CXCL5與PD-L1聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后的意義，具有一定創(chuàng)新性。如上所述，采用免疫組織化學(xué)的方法在78例結(jié)腸直腸癌組織樣本中分別檢測CXCL5和PD-L1的表達(dá)，并將結(jié)果與臨床隨訪資料進(jìn)行對比。筆者發(fā)現(xiàn)CXCL5在腫瘤組織中高表達(dá)。CXCL5的高表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期相關(guān)，而與性別、年齡、組織學(xué)分型無明顯相關(guān)性。同樣，PD-L1蛋白在結(jié)腸直腸癌組織中也呈現(xiàn)高表達(dá)，在癌旁正常組織中幾乎不表達(dá)。且PD-L1高表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期相關(guān)，而與性別、年齡、組織學(xué)分型無明顯相關(guān)性。這與Droeser等[20]的研究結(jié)果大致相符。

生存相關(guān)分析結(jié)果顯示，TNM分期、CXCL5高表達(dá)、PD-L1高表達(dá)是結(jié)腸直腸癌病人總生存的預(yù)后危險(xiǎn)因素。多因素回歸分析顯示，TNM分期和PD-L1高表達(dá)成為結(jié)腸直腸癌病人總生存的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。CXCL5高表達(dá)不是獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。表明PD-L1比CXCL5能更好地預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人的預(yù)后。這與國內(nèi)Wang等[22]報(bào)道一致，在膀胱癌病人中，PD-L1的表達(dá)水平是一個獨(dú)立可評估膀胱癌病人預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。

生存分析顯示CXCL5在腫瘤組織中的上調(diào)與結(jié)腸直腸癌病人較差的預(yù)后呈顯著正相關(guān)。與CXCL5低表達(dá)的結(jié)腸直腸癌病人相比，CXCL5高表達(dá)的結(jié)腸直腸癌病人有較差的總生存率。相反，Speetjens等[23]證明腫瘤組織中CXCL5低表達(dá)與結(jié)腸直腸癌病人的不良預(yù)后呈正相關(guān)。將這種現(xiàn)象歸因于T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤，這種相反結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是研究中Ⅰ和Ⅱ期病人比例較高（67.1%比61.5%），且無Ⅳ期病人。

本研究對PD-L1表達(dá)情況與結(jié)腸直腸癌病人生存期所進(jìn)行的分析結(jié)果顯示，PD-L1低表達(dá)組5年生存率及平均生存時間明顯優(yōu)于高表達(dá)組。該結(jié)果與大多數(shù)研究所報(bào)道的結(jié)果一致[19]。Shi等[19]研究結(jié)果顯示，PD-L1高表達(dá)的結(jié)腸直腸癌病人腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)率、腫瘤相關(guān)死亡率顯著升高，總體生存率顯著下降，提示PD-L1的表達(dá)水平可預(yù)測腫瘤進(jìn)展及相關(guān)死亡。

最后，筆者探討CXCL5與PD-L1聯(lián)合對結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后的影響，并依據(jù)CXCL5與PD-L1表達(dá)的4組獨(dú)立樣本，發(fā)現(xiàn)CXCL5高表達(dá)PD-L1高表達(dá)組較CXCL5高表達(dá)PD-L1低表達(dá)組預(yù)后差，提示在CXCL5高表達(dá)時，PD-L1直接或間接影響CXCL5所影響的預(yù)后，PD-L1表達(dá)水平是影響預(yù)后的一個獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，CXCL5高表達(dá)PD-L1高表達(dá)組較另外3組（CXCL5高表達(dá)PDL1低表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1高表達(dá)組、CXCL5低表達(dá)PD-L1低表達(dá)組）5年生存率顯著降低。表明CXCL5與PD-L1聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后具有更好的預(yù)測效果。

目前，對于CXCL5與PD-L1在結(jié)腸直腸癌的表達(dá)情況已有相關(guān)研究，然而對于兩者相關(guān)性以及聯(lián)合影響結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后的研究尚未成熟。本研究首次提出CXCL5與PD-L1的相互影響，以及兩者聯(lián)合可更精準(zhǔn)預(yù)測結(jié)腸直腸癌病人預(yù)后。這有利于對亞群病人的篩選。此外，從治療角度，降低趨化因子表達(dá)水平，理論上可能對腫瘤病人預(yù)后有正向作用。除相關(guān)靶點(diǎn)藥物的研發(fā)，護(hù)理因素在該過程中也可能起到重要作用。綜合護(hù)理措施主要從心理護(hù)理、疼痛護(hù)理、生命體征監(jiān)測以及并發(fā)癥護(hù)理等，根據(jù)病人的不同情況給予針對性護(hù)理[24]，可加速創(chuàng)面的愈合，控制趨化因子，降低炎性反應(yīng)，促進(jìn)康復(fù)。

因此，深入探討趨化因子在結(jié)腸直腸癌預(yù)后中的作用，有助于醫(yī)護(hù)人員從多角度采取多種策略以期提高預(yù)后生存水平，符合結(jié)腸直腸癌多學(xué)科綜合治療的理念[25]。相關(guān)研究有待進(jìn)一步開展。