楊 迪，盧定強(qiáng)，王新仙

(南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211800)

?；切苋パ跄懰崾悄懰犷愃幬铮切苣懼械挠行С煞?，主要用于治療膽囊或膽管膽固醇結(jié)石疾病[1-2]。由意大利貝斯迪大藥廠于1991年研發(fā)成功并獲批準(zhǔn)生產(chǎn)，2006年以商品名滔羅特(Taurolite)獲準(zhǔn)在中國銷售，是最新的第三代口服膽汁酸[3]。其親水性較熊去氧膽酸高，溶石速度更快，溶石率高達(dá)67.7%[4]，安全性也更好。同時(shí)具有熊去氧膽酸膠囊的所有功能[5]，主要包括：利膽[6]，神經(jīng)保護(hù)[7]，干細(xì)胞分化[8]和鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[9]。因此，高效合成牛磺熊去氧膽酸具有重要的研究意義。

目前主要有4種不同的化學(xué)合成牛磺熊去氧膽酸的方法。Antonio等[10]報(bào)道的第一條路線：使用熊去氧膽酸與氯甲酸乙酯先反應(yīng)形成酸酐，再與?；撬岱磻?yīng)生成牛磺熊去氧膽酸。混合酸酐是現(xiàn)在研究最多的方法,反應(yīng)路線短，而第一條路線所使用的方法反應(yīng)時(shí)間也短，2～3 h即可完成且收率平均都在65%以上。但是生成的混合酸酐易分解，溫度也需要被嚴(yán)格地控制。所用起始原料熊去氧膽酸過于昂貴，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。朱強(qiáng)等[11]報(bào)道了第二條路線：以熊去氧膽酸為原料，先在甲酸、高氯酸作用下對(duì)羥基進(jìn)行甲酰化，然后用氯化亞砜使羧基變?yōu)轷Ｂ?，進(jìn)而與?；撬嶂械陌被磻?yīng)，形成酰胺，最后在堿性條件下脫掉保護(hù)基，形成?；切苋パ跄懰?。但該方法所得收率不高，在45%左右，且比混合酸酐法多了兩步反應(yīng)。由于合成路徑的延長，還增加了工藝的成本，因而不適合大規(guī)模生產(chǎn)。Dayal等[12]報(bào)道了第三條路線：使用了縮合劑2-乙氧基-1-乙氧碳?；?1,2-二氫喹啉，使得熊去氧膽酸與?；撬?，在三乙胺作用下，以乙醇做溶劑，得到了67%的收率，該方法中所用縮合劑價(jià)格較貴，制備方法也比較繁瑣，因而也不適合應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)展。王海龍等[13]報(bào)道了第四條路線：通過熊去氧膽酸在亞磷酸三乙酯和三乙胺作用下，與二硫化二苯并噻唑縮合，再與牛磺酸反應(yīng)得到?；切苋パ跄懰幔摲椒偸章始s為76%。但是所形成的活性硫酯中間體不穩(wěn)定，反應(yīng)環(huán)境較難控制，因此不易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

上述路線均以熊去氧膽酸為起始原料，價(jià)格昂貴。而且反應(yīng)中所用試劑具有毒性或者難以制備，均不適合于大規(guī)模生產(chǎn)。針對(duì)這種情況，筆者對(duì)操作較簡(jiǎn)單的第一條路線進(jìn)行改進(jìn)，以鵝去氧膽酸為起始原料，以期獲得操作簡(jiǎn)單，原料較為廉價(jià)易得且適合工業(yè)化生產(chǎn)的反應(yīng)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

LC-2030A型高效液相色譜儀，日本島津公司；AVANCE AV-400型MHz型核磁共振儀，瑞士Bruker公司；6520Q-TOF型質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；所有試劑均為市售化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.2 合成方法

1.2.1 熊去氧膽酸的制備

取80 g鵝去氧膽酸A投入到1 000 mL三口瓶中，將250 ml丙酮-水(體積比為3∶ 1，)倒入體系中，攪拌使其溶解。將52 g N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)溶于250 mL丙酮-水(體積比為3∶ 1)形成NBS渾濁液，將其緩慢滴加入三口瓶中，30 ℃下攪拌反應(yīng)2 h，經(jīng)高效液相(HPLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)完畢。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%NaHSO3，旋蒸，除去部分丙酮，析出部分固體。滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%HCl，調(diào)節(jié)pH為1～2，使得固體全部析出，抽濾。水洗固體至中性，用無水乙醇作為溶劑重結(jié)晶再干燥，得白色固體7-酮基膽烷酸B 78 g，純度為98.5%。

上述產(chǎn)物取出10 g溶解在400 mL異丙醇中，加入叔丁醇鉀2.5 g，分批加入硼氫化鈉2.9 g，于40 ℃反應(yīng)24 h，HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完畢后抽濾，濾液用水和二氯甲烷萃取。將異丙醇相濃縮蒸干，得熊去氧膽酸C粗品，無水乙醇重結(jié)晶，得白色固體8.8 g，純度98%。兩步反應(yīng)總收率為85.8%。

MS(m/z):392.6；1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ:11.94(s, 1H, 24—COOH), 4.44(d, 1H, 3α—OH), 3.87(d, 1H, 7β—OH), 0.99(s, 3H, 21—CH3), 0.88(s, 3H, 19—CH3), 0.61(s, 3H, 18—CH3)。

1.2.2 ?；切苋パ跄懰岬暮铣?/p>

于圓底燒瓶中加入5 g熊去氧膽酸粗品C和30 mL丙酮，攪拌溶解，后冰浴降溫至0 ℃，加入三乙胺1.55 g。向體系中滴加氯甲酸異丁酯1.92 g，反應(yīng)1 h，HPLC監(jiān)測(cè)沒有原料，反應(yīng)結(jié)束。抽濾取濾液，待用，此步反應(yīng)無須進(jìn)行處理，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

將NaOH 0.65 g溶解在H2O 10 mL中，加入1.6 g牛磺酸攪拌30 min，形成?；撬徕c溶液，滴加到上述所得濾液中，25 ℃反應(yīng)3 h，HPLC監(jiān)控反應(yīng)結(jié)束。旋蒸溶劑，體系為黃色黏稠物，加入少量水?dāng)嚢枞芙猓CL調(diào)節(jié)pH 3～4，乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯相，旋蒸得粗制?；切苋パ跄懰酔，用丙酮-水(體積比為13∶ 1)重結(jié)晶得?；切苋パ跄懰酔 5.1 g精制品，純度為98%。

MS(m/z):498，1H NMR(D2O),δ: 3.65～3.62(m, 2H, C7—H, C3—H), 3.60(t, 2H, CH2NH), 3.11(t, 2H, CH2SO3H), 2.37～2.33(m, 1H, C23—H), 2.24～2.21(m, 1H, C23—H), 2.08～2.05(m, 1H, C12—Hβ), 1.98～1.75(m, 5H, C16—Hα, C15—Hα, C6—Hβ, C1—Hα, C22—Hβ), 1.69～1.58(m, 5H, C2—Hβ, C4—Hα, C6—Hα, C4—Hβ, C5—Hβ), 1.55～1.43(m, 5H, C8—Hβ, C9—Hα, C11—Hα, C15—Hβ, C20—H), 1.42～1.22(m, 6H, C22—Hα, C16—Hβ, C11—Hβ, C14—Hα, C2—Hα, C12—Hα), 1.17～1.07(m, 2H, C17—Hα, C1—Hβ), 1.01(d, 3H, C21—H), 0.99(s, 3H, C19—H3), 0.75(s, 3H, C18—H)。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響熊去氧膽酸合成的因素

在氧化反應(yīng)中，利用了NBS對(duì)羥基的選擇性氧化。在鵝去氧膽酸分子結(jié)構(gòu)中3位和7位均有羥基，NBS進(jìn)攻兩者的能量卻有不同，優(yōu)先選擇能量低的反應(yīng)。雖然兩者能量有差距，但是當(dāng)NBS足夠多的時(shí)候，理論上能量高的羥基也會(huì)反應(yīng)，這就容易帶來新的雜質(zhì)，因此控制NBS的投料也是很有必要的，因?yàn)檫^少了反應(yīng)不完全，過多了則會(huì)有副反應(yīng)。于是綜合考察鵝去氧膽酸與NBS投料摩爾比對(duì)熊去氧膽酸產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表1。由表1可知：當(dāng)鵝去氧膽酸和NBS摩爾比在1∶ 1.2時(shí)，產(chǎn)率最佳。

表1 投料摩爾比對(duì)氧化反應(yīng)的影響

氧化反應(yīng)中，溫度過低，反應(yīng)達(dá)不到所需的活化能，使得反應(yīng)過慢或者基本不反應(yīng)；溫度過高，也會(huì)使得NBS的活性增高，3位羥基也會(huì)被氧化，導(dǎo)致副反應(yīng)產(chǎn)生?？疾鞙囟葘?duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見表2。由表2可知：氧化溫度在30 ℃時(shí)的產(chǎn)率最佳。還原反應(yīng)中，溫度也需要嚴(yán)格控制，因?yàn)檫€原反應(yīng)是放熱反應(yīng)，加還原劑時(shí)，溫度過高會(huì)爆炸，溫度過低則反應(yīng)緩慢，還會(huì)影響反應(yīng)進(jìn)度且可能導(dǎo)致反應(yīng)不完全。因此，考察溫度對(duì)還原反應(yīng)的影響(表3)。由表3可知：還原反應(yīng)的最佳溫度為40 ℃，此時(shí)產(chǎn)率最高，為84.7%。

表2 溫度對(duì)氧化反應(yīng)的影響

表3 溫度對(duì)還原反應(yīng)的影響

2.2 影響?；切苋パ跄懰岷铣傻囊蛩?/h3>

考察縮合劑的選擇對(duì)反應(yīng)收率的影響。保持其他條件不變，分別使用氯甲酸乙酯、氯甲酸正丙酯、氯甲酸正丁酯和氯甲酸異丁酯作為縮合劑，記錄最終收率，結(jié)果見表4。由表4可知：當(dāng)選用氯甲酸異丁酯時(shí)的收率最高，達(dá)80.1%，可能是由于其他縮合劑酯的活性較高，底物分子中醇羥基可能與之發(fā)生了副反應(yīng)，導(dǎo)致收率較低。

表4 縮合劑對(duì)反應(yīng)收率的影響

考察熊去氧膽酸和氯甲酸異丁酯的投料摩爾比對(duì)反應(yīng)收率的影響，結(jié)果見表5。由表5可知：隨著兩者投料比增大，產(chǎn)率明顯增大，當(dāng)達(dá)到1∶ 1.1時(shí)，收率最大，為80.2%。

表5 投料摩爾比對(duì)反應(yīng)收率的影響

考察重結(jié)晶混合溶劑比例對(duì)純度和產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表6。由表6可知：當(dāng)丙酮和水的比例為13∶ 1時(shí)，產(chǎn)率較高，為80.1%；同時(shí)純度也最高，為98.1%。當(dāng)丙酮量過多時(shí)，產(chǎn)物從溶劑中析出過少，產(chǎn)率較低，且產(chǎn)物過少時(shí)，雜質(zhì)也會(huì)帶出，從而影響產(chǎn)物純度。

表6 重結(jié)晶混合溶劑比例對(duì)產(chǎn)率的影響

?；切苋パ跄懰岷铣陕肪€見圖1。由圖1可知：以易得的鵝去氧膽酸為原料，通過氧化還原反應(yīng)先形成熊去氧膽酸，再通過混合酸酐法形成最終產(chǎn)物。

圖1 ?；切苋パ跄懰岷铣陕肪€Fig.1 Synthetic route of tauroursodeoxycholic acid

3 結(jié)論

以較為廉價(jià)收率為80.1%；易得的鵝去氧膽酸為原料，通過氧化還原反應(yīng)先形成熊去氧膽酸，收率為85.8%，再通過混合酸酐法形成最終產(chǎn)物，收率為80.1%，反應(yīng)總收率為68.75%，純度為98.1%。產(chǎn)物經(jīng)1H NMR和MS結(jié)構(gòu)得到確證。

通過比較反應(yīng)條件，確定反應(yīng)最佳工藝參數(shù)，鵝去氧膽酸和NBS投料比為1∶ 1.2時(shí)最佳，氧化反應(yīng)溫度在30 ℃最佳，還原溫度在40 ℃最佳。酯的選擇為氯甲酸異丁酯最優(yōu)，氯甲酸異丁酯和熊去氧膽酸投料比在1∶ 1.1時(shí)最佳，?；切苋パ跄懰岽制分亟Y(jié)晶混合溶劑丙酮和水比例為13∶ 1時(shí)最佳。該工藝簡(jiǎn)單且成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。