封明軍 ，雷富臣 ，豆靜，王新建 *

(1塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

（2南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

蘋果（Malus pumila）屬薔薇科蘋果屬植物，是世界上五大果樹（柑橘、蘋果、葡萄、香蕉、梨）之一，主要分布于北溫帶，橫跨歐亞大陸和北美洲，緯向幅度寬達(dá)30°（20°～50°N），栽培歷史悠久［1-3］。如今，世界蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展呈矮化栽培的趨勢(shì)，選擇適宜的矮栽品種是實(shí)現(xiàn)矮化栽培的關(guān)鍵。蘋果組培技術(shù)的成熟逐漸為蘋果矮化砧木快繁提供了技術(shù)保障［4］，目前建立的蘋果矮化砧木快繁體系主要包括‘M9’‘M26’‘八棱海棠’等［5-7］。近年來，矮化自根砧‘T337’作為世界各國應(yīng)用最廣泛、最成功的脫毒矮化砧木，具有主干性強(qiáng)、易成花、豐產(chǎn)性好以及適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，被大量運(yùn)用于矮化密植園中［8］。當(dāng)前‘T337’組培快繁報(bào)道均以莖尖和莖段作為外植體［7,9］，未見以休眠芽為外植體的誘導(dǎo)研究。同時(shí)愈傷組織在植株再生、分子機(jī)理和轉(zhuǎn)基因等方面研究中被作為重要的試驗(yàn)材料［10-12］，由于研究目的不同所需愈傷組織類型不同，通過不同培育條件能夠獲取目標(biāo)所需愈傷組織。本試驗(yàn)研究不同外植體類型和消毒時(shí)間，探究不同激素組合對(duì)啟動(dòng)誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)和愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以及葉片暗處理時(shí)間與愈傷形成的關(guān)系，以期建立‘T337’較優(yōu)組培誘導(dǎo)方法和葉片再生體系，為推進(jìn)優(yōu)化蘋果矮化砧組織培養(yǎng)技術(shù)提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料于3～4月中旬采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師10團(tuán)苗圃基地（81°18′E，40°35′N）蘋果矮化自根砧‘T337’枝條，將剪下的枝條用保鮮膜包裹帶回實(shí)驗(yàn)室，插入自來水中培養(yǎng)一周待葉芽飽滿接近萌動(dòng)，使用時(shí)將其剪成2～3 cm帶單芽的莖段或幼嫩莖尖。

1.2 方法

1.2.1 外植體類型及消毒時(shí)間的篩選

試驗(yàn)以單芽莖段和幼嫩莖尖為外植體，通過消毒試驗(yàn)進(jìn)行篩選適宜的外植體類型。

單芽莖段消毒先用75%酒精處理30 s，后用2%次氯酸鈉處理10 min，無菌水沖洗3次，用手術(shù)刀將休眠芽鱗片及周圍白色絨毛剝?nèi)ィ邢滦菝哐窟M(jìn)行二次消毒，設(shè)置不同消毒時(shí)間處理組合，75%酒精三個(gè)處理時(shí)間（5 s、7 s、9 s），1%的次氯酸鈉三個(gè)浸泡處理時(shí)間（1 min、3 min、5 min），共9個(gè)處理組合。

幼嫩莖尖僅采取一次消毒，設(shè)置不同消毒時(shí)間處理組合，75%酒精三個(gè)處理時(shí)間（10s、20s、30s），2%次氯酸鈉兩個(gè)浸泡處理時(shí)間（10 min、15 min），共6個(gè)處理組合，無菌水沖洗3次，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+6-BA 1.50 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1）上。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，接種后置于培養(yǎng)室，溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間14 h/d（后續(xù)培養(yǎng)條件皆與此相同），接種30 d后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和褐化率。

污染率=外植體污染數(shù)∕外植體接種數(shù)×100%

死亡率=外植體死亡數(shù)∕（外植體接種數(shù)-外植體死亡數(shù)）×100%

褐化率=外植體褐化數(shù)∕外植體接種數(shù)×100%

1.2.2 啟動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

選擇6-BA與NAA的激素組合，以MS為基本培養(yǎng)基，加入30 g·L-1蔗糖、6.5 mg·L-1瓊脂、不同濃度的6-BA（1.00 mg·L-1、1.50 mg·L-1、2.00 mg·L-1）和 NAA（0.10 mg·L-1、0.30 mg·L-1、0.50 mg·L-1），pH值為5.8，以空白MS培養(yǎng)基為對(duì)照，共10個(gè)處理組合，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)各處理的芽誘導(dǎo)率。

1.2.3 增殖培養(yǎng)基的篩選

將前期誘導(dǎo)獲得的幼苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，內(nèi)附加不同濃度的6-BA（0.50 mg·L-1、0.75 mg·L-1、1.00 mg·L-1）和 IBA（0.30 mg·L-1、0.50 mg·L-1），每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)各處理芽的增殖系數(shù)和平均芽高。

1.2.4 愈傷組織的誘導(dǎo)

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗，用剪刀將葉片剪成大小約0.5 cm2，遠(yuǎn)軸面朝上接種在培養(yǎng)基上，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置附加2,4-D與6-BA的組合和6-BA與NAA組合的8個(gè)處理，見表1，每個(gè)組合接種10瓶，從中選取最優(yōu)的愈傷組織誘導(dǎo)組合，設(shè)置不同的暗培養(yǎng)天數(shù)（0 d、7 d、14 d、21 d、28 d），統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。

表1 蘋果‘T337’葉片愈傷組織誘導(dǎo)組合

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft office Excel 2010和DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較分析差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體類型及消毒時(shí)間對(duì)‘T337’誘導(dǎo)的影響

從表2可知，隨著酒精和次氯酸鈉處理時(shí)間的延長(zhǎng)，休眠芽和莖尖培養(yǎng)的污染率呈下降趨勢(shì)，死亡率和褐化率呈上升趨勢(shì)，污染率最高的為休眠芽酒精處理5 s，次氯酸鈉浸泡1 min，污染率為58.89%，原因可能是酒精處理時(shí)間過短未能使消毒劑次氯酸鈉充分滲入消毒造成，但休眠芽消毒褐化率整體結(jié)果較低（圖1a），且長(zhǎng)勢(shì)較好（圖1b、圖1c）。死亡率最高的為莖尖酒精處理30 s，次氯酸鈉浸泡15 min，死亡率為64.41%，雖然其污染率較低，但同時(shí)褐化率也是最高的為70.00%（圖1d）。相比兩種外植體生長(zhǎng)及消毒處理表現(xiàn)，以莖尖作為外植體組培時(shí)死亡率和褐化率遠(yuǎn)高于休眠芽，且宜長(zhǎng)愈傷組織不利于芽的誘導(dǎo)（圖1e、圖1f），說明休眠芽更適宜作為‘T337’組培的外植體材料，綜合比較，最優(yōu)的消毒處理方法為酒精處理5 s，次氯酸鈉處理5 min，污染率、死亡率和褐化率都相對(duì)較低。

表2 不同外植體類型及消毒時(shí)間處理下污染率、死亡率和褐化率的比較

圖1 外植體消毒試驗(yàn)

2.2 不同激素配比組合對(duì)休眠芽組培誘導(dǎo)的影響

初代培養(yǎng)選用休眠芽作為外植體，由表3可知，當(dāng)6-BA濃度為1.00 mg·L-1，NAA濃度為0.30 mg·L-1時(shí)，休眠芽誘導(dǎo)率最高為63.33%，休眠芽在接種6 d左右開始萌動(dòng)。在空白MS培養(yǎng)基中，外植體約16 d才有萌發(fā)跡象，且萌發(fā)后長(zhǎng)勢(shì)較弱。在同一NAA濃度下，誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的提升而逐漸下降，在同一6-BA濃度下，誘導(dǎo)率隨著NAA濃度的提高而整體趨向于升高?！甌337’休眠芽誘導(dǎo)最適宜的激素組合為6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.30 mg·L-1，其次為6-BA 1.50 mg·L-1+NAA 0.50 mg·L-1。

表3 不同激素配比對(duì)休眠芽萌動(dòng)與誘導(dǎo)的影響

2.3 不同激素配比組合對(duì)組培苗增殖培養(yǎng)的影響

增殖試驗(yàn)結(jié)果見表4，在6-BA濃度逐漸增加時(shí)，增殖系數(shù)整體呈先上升后降低的趨勢(shì)，在6-BA濃度為 0.75 mg·L-1，IBA 為 0.50 mg·L-1時(shí)增殖系數(shù)為2.60，平均芽高為2.41 cm，均達(dá)到最高值，且組培苗生長(zhǎng)旺盛，葉片翠綠(圖2a)，其增殖系數(shù)除了與6-BA 0.50 mg·L-1+IBA 0.30 mg·L-1(圖2b)激素組合無顯著差異外，均顯著高于其他濃度處理；平均芽高除了與 6-BA 0.75 mg·L-1+IBA 0.30 mg·L-1激素組合無顯著差異外(圖2c)，均顯著高于其他濃度處理。綜合考慮，適宜‘T337’增殖培養(yǎng)的6-BA添加量為0.75 mg·L-1，IBA添加量為0.50 mg·L-1，其生長(zhǎng)狀態(tài)最理想。

圖2 組培苗增殖試驗(yàn)

表4 不同激素配比對(duì)組培苗從生芽誘導(dǎo)的影響

2.4 不同處理對(duì)愈傷組織形成的影響

2.4.1 不同激素處理對(duì)‘T337’葉片愈傷組織形成的影響

由表5可知，含有2,4-D激素的組合(圖3a～圖3d)，除了處理1外均能高效地誘導(dǎo)愈傷組織，且愈傷組織發(fā)生較快，最快的為7天，愈傷組織特征均較為致密，且誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的上升而增加。含有6-BA和NAA的組合(圖3e～圖3h)，誘導(dǎo)的愈傷組織整體較疏松，愈傷開始發(fā)生的時(shí)間也較晚，在6-BA濃度加倍情況下，愈傷組織也能比較有效地形成，但顏色和質(zhì)地較含有2,4-D的組合差，且各處理間愈傷形成差異較大。說明愈傷組織的形成在2,4-D和NAA一定范圍濃度下可以產(chǎn)生類似的組織，而在僅使用6-BA和NAA時(shí)愈傷組織形成會(huì)較明顯受到濃度變化的影響。綜上，最佳的激素組合為處理4，愈傷組織發(fā)生時(shí)間為7 d，誘導(dǎo)率為69.33%

表5 不同激素配比對(duì)葉片愈傷組織形成的影響

圖3 葉片愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)

2.4.2 不同暗培養(yǎng)天數(shù)對(duì)愈傷組織形成的影響

選取最優(yōu)的愈傷組織誘導(dǎo)組合2,4-D 2.00 mg·L-1+6-BA 0.50 mg·L-1的培養(yǎng)基進(jìn)行暗培養(yǎng)。由表6可知，全光照培養(yǎng)條件下基本無愈傷組織形成，且形成的少數(shù)愈傷組織質(zhì)地較差，最終會(huì)逐漸變褐死亡。最佳的暗培養(yǎng)天數(shù)以7～14 d為宜，形成的愈傷組織轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)后增殖速度快，顏色鮮艷有光澤；若超過14 d暗培養(yǎng)時(shí)間，愈傷組織增殖速度慢，且逐漸呈灰白色、底部變褐。因此說明‘T337’葉片愈傷組織的誘導(dǎo)需要7～14 d的黑暗條件來啟動(dòng)，而后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)入光照條件下進(jìn)行后續(xù)的生長(zhǎng)分化。

表6 不同暗培養(yǎng)天數(shù)對(duì)愈傷組織形成的影響

3 討論

蘋果組織培養(yǎng)過程中外植體的建立尤為重要，選取合適的外植體類型直接影響無菌苗的獲取效率。理論上植物細(xì)胞具有全能性，任一部位都能誘導(dǎo)出完整的植株，但各個(gè)部位所誘導(dǎo)的結(jié)果存在差異［13］。在以往有關(guān)‘T337’組培誘導(dǎo)的研究中外植體材料均為莖段和莖尖［7,9］，以休眠芽為外植體的研究在果樹中報(bào)道較少，在有關(guān)柿［14-15］的組織培養(yǎng)中也少有報(bào)道。通過對(duì)比莖尖和休眠芽?jī)煞N外植體消毒結(jié)果，說明休眠芽更適合作為外植體材料，進(jìn)行二次消毒的方法能有效避免將莖尖作為外植體時(shí)褐化率過高，同時(shí)使死亡率和污染率保持較低水平。另外，消毒時(shí)間直接影響外植體的建立，同屬不同種的不同外植體器官所需消毒時(shí)間也存在一定的差異，本試驗(yàn)表明隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體組織所受毒害越重［16］，褐化率死亡率越高，造成誘導(dǎo)效果不理想的結(jié)果與成思瓊等［7］對(duì)‘T337’的消毒試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

在外植體啟動(dòng)階段，植物外植體生長(zhǎng)發(fā)育情況受到不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、配比和濃度的影響［17］，試驗(yàn)在同一NAA濃度下，隨著6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)率逐漸降低，在6-BA濃度為1.00 mg·L-1時(shí)，其誘導(dǎo)率最高，這與馬榮群等［18］研究結(jié)果一致，在啟動(dòng)培養(yǎng)基中添加6-BA1.00 mg·L-1和NAA0.01 mg·L-1的萌芽誘導(dǎo)效果較好。在增殖培養(yǎng)中，增殖系數(shù)是衡量增殖效果的重要指標(biāo)，成思瓊等［7］和韓秀清［9］對(duì)‘T337’繼代培養(yǎng)研究表明，6-BA和IBA濃度在0.50～0.75 mg·L-1之間增殖系數(shù)和平均芽高均保持較高水平，本研究與其結(jié)果相似。在培養(yǎng)基上添加不同濃度的6-BA、NAA和IBA來觀察外植體啟動(dòng)誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)的變化，為優(yōu)化‘T337’組織培養(yǎng)方法和再生體系提供理論基礎(chǔ)，但其他種類和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘T337’組織培養(yǎng)誘導(dǎo)體系的影響和作用有待進(jìn)一步深入研究。

葉片愈傷組織的誘導(dǎo)中通過不同配比及濃度的外源激素能夠獲得目標(biāo)所需且質(zhì)地優(yōu)良的類型，高兵等［19］在“嘎拉”蘋果葉片愈傷組織誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)含2,4-D的組合都能比較高效地誘導(dǎo)愈傷組織的形成，但隨著2,4-D濃度的變化，愈傷組織的特征變化也較大，這與本試驗(yàn)結(jié)果存在部分差異，可能是由于基因型不同產(chǎn)生愈傷組織形態(tài)特征及所需的激素種類和濃度也存在差異。外界環(huán)境因素，如溫光等都能夠明顯影響蘋果植株組織培養(yǎng)的過程，而其中暗培養(yǎng)是誘導(dǎo)葉片愈傷形成的關(guān)鍵步驟之一。王瑞敏等［20］對(duì)‘高原之火’北美海棠的葉片進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，光照培養(yǎng)下葉片無愈傷產(chǎn)生，而轉(zhuǎn)入暗培養(yǎng)第7 d可誘導(dǎo)出生活力旺盛的幼嫩白色愈傷，至15 d時(shí)大量的愈傷組織長(zhǎng)出。本試驗(yàn)完全光照培養(yǎng)的葉片愈傷組織誘導(dǎo)率極低，而經(jīng)過7～14 d暗培養(yǎng)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)后增殖速度快，顏色鮮艷有光澤，說明適宜天數(shù)的黑暗條件能夠有效地誘導(dǎo)出愈傷組織。這與孫克聰［10］的研究結(jié)果一致，‘T337’葉片愈傷組織誘導(dǎo)需要暗培養(yǎng)天數(shù)為14 d。崔美等［21］在‘國光’‘富士’蘋果葉片愈傷組織誘導(dǎo)及達(dá)克東等［22］在‘千秋’蘋果葉片愈傷組織誘導(dǎo)上均有同樣的結(jié)論。目前關(guān)于蘋果矮化砧‘T337’組培快繁的研究較少，葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的構(gòu)建有待進(jìn)一步地深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)論表明，‘T337’最佳外植體類型為休眠芽，且采取二次消毒，先用75%酒精處理30 s，2%次氯酸鈉處理10 min，然后二次消毒為75%酒精處理5 s，1%次氯酸鈉處理5 min。最適宜的啟動(dòng)誘導(dǎo)激素組合為 6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.30 mg·L-1，在第6 d芽就開始萌發(fā)，誘導(dǎo)率高達(dá)63.33%。增殖培養(yǎng)在6-BA 0.75 mg·L-1+IBA 0.50 mg·L-1培養(yǎng)基中增殖數(shù)最多為2.60且平均芽高最高為2.41 cm。葉片愈傷組織的誘導(dǎo)在含有2,4-D的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的愈傷組織較致密且生長(zhǎng)較快，激素組合為2,4-D 2.00 mg·L-1+6-BA 0.50 mg·L-1時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高為69.33%，暗培養(yǎng)最佳時(shí)間為7～14 d。