血紅素加氧酶-1促進(jìn)導(dǎo)管相關(guān)性血栓溶解再通的實(shí)驗(yàn)研究

韋佳妮，趙慧函，蔣慶娟，文萃，黃欣欣，凌瑛，應(yīng)燕萍

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院護(hù)理部，廣西南寧530021）

中心靜脈導(dǎo)管（central venous catheter，CVC）是置入大靜脈的長(zhǎng)、軟、細(xì)、中空的導(dǎo)管，使用CVC 在帶來(lái)便利的同時(shí)，其導(dǎo)致的并發(fā)癥不容忽略，尤其是導(dǎo)管相關(guān)血栓（catheter related thrombosis，CRT）形成[1-2]。CRT 是指因置管或?qū)Ч苤苯訐p傷血管內(nèi)膜及患者自身狀態(tài)等因素，使導(dǎo)管外壁或內(nèi)壁血凝塊形成的過(guò)程[3]。目前CRT 的治療主要為抗凝和溶栓治療，其中抗凝治療目的是阻止血栓進(jìn)一步發(fā)展，使血栓緩慢地自然機(jī)化再通，但并沒(méi)有加速血栓溶解過(guò)程[4]。溶栓治療可以快速去除血栓，但是其僅適用于新鮮形成的血栓，且在一些特殊病例獲利大于出血的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)才推薦使用[5]。因此，血栓仍需自身緩慢機(jī)化再通，而血栓延遲溶解直接影響血栓后并發(fā)癥的發(fā)生及患者預(yù)后[6]。血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）可通過(guò)介導(dǎo)復(fù)雜炎癥反應(yīng)及炎癥依賴性，在血管新生、傷口的愈合、血管重塑過(guò)程發(fā)揮重要作用[7]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，HO-1 在血栓的溶解再通過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]，目前對(duì)于血栓的研究中大多集中于深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）[9]，而對(duì)于CRT 的溶解再通過(guò)程的研究較少，因此本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠CRT 模型，通過(guò)注射HO-1 激動(dòng)劑與抑制劑，觀察HO-1 在血栓溶解再通中的作用效果，以期為臨床CRT 溶解再通過(guò)程及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠72 只，周齡7～8 周，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SCXK 桂2020-0003），本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則，并通過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（審批號(hào)：202008006）。

1.2 主要儀器及試劑

多功能酶標(biāo)儀（Synergy H1，美國(guó)）、切片機(jī)（Leica，德國(guó)）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，美國(guó)）、頸靜脈導(dǎo)管及堵頭（思科諾思生物科技有限公司，中國(guó)）、大鼠HO-1、IL-6、IL-10 ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國(guó)）、鈷原卟啉（Sigma，美國(guó)）、錫原卟啉（Senta Cruz Biotechnology，美國(guó)）、HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)）、RPLP1 及HO-1 引物（上海生工生物工程股份有限公司，中國(guó)）、CD31 抗體（AF6191，Affinity Biosciences，美國(guó)）、通用二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模方法 參照課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[10]，采用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，右側(cè)頸部備皮，常規(guī)消毒、鋪巾，沿氣管右側(cè)0.5 cm 縱切頸部1～2 cm，導(dǎo)管至上腔靜脈，縫合傷口，常規(guī)消毒。

1.3.2 分組及干預(yù) 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)置管7 d后血栓高發(fā)，10 d 后血栓形成穩(wěn)定[11]。因此，本研究選取置管后10 d 經(jīng)B 超確診血栓形成的大鼠CRT模型作為研究對(duì)象，采用動(dòng)物隨機(jī)分組軟件將大鼠隨機(jī)分為模型組、HO-1 激動(dòng)劑組、HO-1 抑制劑組，每組24 只。激動(dòng)劑組和抑制劑組在置管10 d后分別腹腔注射鈷原卟啉（protoporphyrin IX cobalt chloride，CoPP）和錫原卟啉（tin protoporphyrin IX，SnPP）5 mg/kg 進(jìn)行干預(yù)，模型組不做干預(yù)。

1.3.3 樣本采集 在干預(yù)后的第1、7、14、28 天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取6 只大鼠，大鼠麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，離心收集血清后放置于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)ELISA 檢測(cè)血清HO-1、IL-6、IL-10 濃度。剪開大鼠置管側(cè)皮膚，取自導(dǎo)管穿刺處至右心房上段血管，一部分血管用于病理切片染色；另一部分血管用于qPCR 檢測(cè)。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1 血栓溶解再通情況 血管組織經(jīng)包埋切片染色后，在光鏡下觀察血栓溶解再通情況，應(yīng)用Image J 圖像分析軟件分析，使用以下公式計(jì)算各組血栓溶解率：溶解率=[（靜脈管腔面積-血栓面積）/靜脈管腔面積]×100%[12]。

1.4.2 CD31 免疫組化染色 血管組織切片、抗原修復(fù)后，加入一抗、二抗，DAB 顯色、蘇木素復(fù)染并在光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算其平均光密度值。

1.4.3 血清HO-1、IL-6、IL-10 含量 應(yīng)用ELISA 法檢測(cè)大鼠HO-1、IL-6、IL-10 含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4.4 qPCR 檢測(cè)血管組織HO-1 mRNA 表達(dá) 使用TRIzol 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，用SYBR Green 法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，設(shè)置復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次。HO-1 序列：上游引物：5′-TCT GCA GGG GAG AAT CTT GC-3′，下游引物：5′-TTG GTG AGG GAA ATG TGC CA-3′。大鼠內(nèi)參RPLP1 序列:上游引物：5′-AAA GCA GCT GGT GTC AAT GTT-3′，下游引物：5′-GCA GAT GAG GCT TCC AAT GT-3′。使用2-△△Ct 法分析qPCR 結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述。不同組之間采用單因素方差分析比較，若方差齊，則使用LSD 法進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊，則使用TamhaneT2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠基本情況及CRT病理形態(tài)

大鼠術(shù)后精神狀態(tài)良好，存活率為100%，置管成功率為100%，導(dǎo)管留置期間無(wú)導(dǎo)管脫出。干預(yù)1 d 后可觀察到各組CRT 形成趨于穩(wěn)定，血栓膠原蛋白成分增多，并可見(jiàn)肉芽組織從靜脈壁向血栓中心形成，血栓開始機(jī)化。隨著時(shí)間增加，血栓體內(nèi)部裂隙擴(kuò)大，并可見(jiàn)有新生管腔樣結(jié)構(gòu)形成。至干預(yù)28 d 后，在血栓內(nèi)部形成新的血管相互吻合再通，使被阻塞的血管部分血流重建，其中HO-1 激動(dòng)劑組接近完全再通，HO-1 抑制劑組中管腔內(nèi)有紅細(xì)胞形成，僅部分再通（圖1）。

圖1 各組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血管內(nèi)血栓HE染色（×50）Figure 1 HE staining of thrombosis in the blood vessel in rats in each group at different time points(×50)

2.2 各組血栓溶解率

各組血栓溶解率隨時(shí)間增長(zhǎng)而增加。其中，HO-1 激動(dòng)劑組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血栓溶解率高于模型組，而HO-1 抑制劑組均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）（表1）。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血栓溶解率（%，±s)Table 1 Comparison of thrombolysis rates in each group at different time points(%,±s)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血栓溶解率（%，±s)Table 1 Comparison of thrombolysis rates in each group at different time points(%,±s)

注：1）與模型比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.01Note:1)P＜0.05 vs.model group;2)P＜0.01 vs.model group

第28天69.830±0.016 88.132±0.0192）48.186±0.0212）221.516＜0.001組別模型組HO-1激動(dòng)劑組HO-1抑制劑組FP第1天13.827±0.002 19.903±0.0142）10.421±0.0101）39.938＜0.001第7天22.902±0.017 42.105±0.0171）17.883±0.0192）103.329＜0.001第14天43.042±0.017 69.389±0.0262）35.697±0.0211）128.011＜0.001

2.3 血管組織CD31的免疫組化檢測(cè)

免疫組化結(jié)果顯示，CD31 表達(dá)于血管內(nèi)皮間隙，與模型組比較，干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)HO-1 激動(dòng)劑組中CD31 的表達(dá)明顯增高，而HO-1 抑制劑組中CD31 的表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2）（表2）。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)CD31平均光密度值的變化(±s)Table 2 Changes in CD31 average optical density at different time points in each group(±s)

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)CD31平均光密度值的變化(±s)Table 2 Changes in CD31 average optical density at different time points in each group(±s)

注：1）與模型組比較，P＜0.01Note:1)P＜0.01 vs.model group

第28天0.047±0.001 0.067±0.0011）0.033±0.0021）240.319＜0.001組別模型組HO-1激動(dòng)劑組HO-1抑制劑組FP第1天0.008±0.001 0.014±0.0011）0.003±0.0011）121.525＜0.001 0.016±0.001 0.025±0.0011）0.010±0.0011）114.515＜0.001第7天第14天0.031±0.001 0.048±0.0011）0.018±0.0011）274.039＜0.001

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血管CD31免疫組織化學(xué)染色（×100）Figure 2 Immunohistochemical staining of CD31 at different time points in each group（×100）

2.4 各組不同時(shí)間點(diǎn)HO-1、IL-6、IL-10含量變化

干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)，HO-1 激動(dòng)劑組HO-1、IL-10含量均高于其他兩組，而IL-6 含量均低于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。HO-1 抑制劑組干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)HO-1、IL-10 含量均低于模型組，IL-6 含量均高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)HO-1、IL-6、IL-10含量變化Figure 3 Changes of HO-1,IL-6 and IL-10 content in each group at different time points

2.5 各組不同時(shí)間點(diǎn)HO-1 mRNA表達(dá)情況

HO-1 激動(dòng)劑組干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)血管組織中HO-1 mRNA 表達(dá)均高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；HO-1 抑制劑組干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)HO-1 mRNA 表達(dá)均低于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組不同時(shí)間點(diǎn)HO-1 mRNA表達(dá)情況變化Figure 4 Changes in HO-1mRNA expression in each group at different time points

3 討論

前期已成功構(gòu)建大鼠CRT 模型，并且通過(guò)B 超、病理切片染色等觀察CRT 發(fā)生發(fā)展過(guò)程，對(duì)CRT形成過(guò)程進(jìn)行了動(dòng)態(tài)研究。發(fā)現(xiàn)大鼠置入CVC 后1～4 d 為CRT 的形成階段；7～10 d 為CRT 形成高發(fā)時(shí)段；10～14 d 為CRT 機(jī)化發(fā)展階段，14 d 血栓開始消退[10-11]。因此，導(dǎo)管留置10 d 是觀察CRT 形成的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。本研究選用導(dǎo)管留置10 d 后血栓形成穩(wěn)定的大鼠CRT 模型，在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究血栓溶解再通的過(guò)程。付健等[13]發(fā)現(xiàn)大鼠下腔靜脈血栓的自然溶解演變過(guò)程伴隨血管新生，其自然溶解演變過(guò)程與本研究相似。

HO-1 是一種誘導(dǎo)酶，其可催化血紅素氧化為一氧化碳（CO）、鐵和膽綠素（BV），這些產(chǎn)物可分別通過(guò)不同途徑發(fā)揮抗炎癥損傷和抗氧化應(yīng)激損傷的作用[14]。在血管組織中，HO-1 保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受各種誘導(dǎo)刺激，在傷口的愈合、血管重塑過(guò)程發(fā)揮重要作用，其具有免疫調(diào)節(jié)作用和促進(jìn)血管新生功能[15]。同時(shí)，HO-1 在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、急性腦梗死等疾病進(jìn)展過(guò)程中具有抗氧化、減輕炎癥反應(yīng)的作用[16]。IL-6 是一種炎癥反應(yīng)因子，能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)；而IL-10 作為一種抗炎因子，能夠抑制促炎因子的釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)[17]。HO-1 被IL-6 高度誘導(dǎo)，而HO-1 負(fù)調(diào)控IL-6，這表明HO-1 和IL-6 之間存在負(fù)反饋循環(huán)；而IL-10和HO-1 通過(guò)正反饋環(huán)相互聯(lián)系，IL-10 誘導(dǎo)可促進(jìn)HO-1 高表達(dá)，從而可發(fā)揮其抗炎作用[18-19]。南川川等[20]研究發(fā)現(xiàn)HO-1 能夠增加膿毒癥大鼠腎臟中血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）表達(dá)，發(fā)揮抗凝血及抗炎作用，從而改善膿毒癥大鼠的腎臟功能。同時(shí)，越來(lái)越多的證據(jù)支持HO-1 誘導(dǎo)在血管損傷中的抗血栓作用，在DVT 形成早期，HO-1可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激、抑制血小板功能和抑制炎癥反應(yīng)等機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制DVT 的形成[8]。在小鼠靜脈血栓模型中，經(jīng)HO-1 基因轉(zhuǎn)染后，血栓顯著減少，血紅素誘導(dǎo)的HO-1 上調(diào)也降低了血凝塊形成和纖溶酶原激活因子抑制物（PAI） 水平，表明HO-1 可能通過(guò)其分解產(chǎn)物直接發(fā)揮抗血栓作用[7,21]。先前有研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)HO-1 高表達(dá)后，DVT 機(jī)化程度和溶解速度明顯加快，抑制HO-1 表達(dá)后，其機(jī)化速度和溶解速度明顯減慢[22]。這與本研究的結(jié)果相似，在本研究中，不同時(shí)間點(diǎn)HO-1 激動(dòng)劑組血栓溶解率均高于模型組，HO-1 抑制劑組血栓溶解率均低于模型組，由此證明HO-1能促進(jìn)血栓的溶解再通。

靜脈血栓的溶解對(duì)于血管恢復(fù)通暢至關(guān)重要，其過(guò)程類似于正常的傷口愈合過(guò)程。需要纖維蛋白溶解、蛋白水解作用、炎癥和血管生成的協(xié)調(diào)作用[23]。血栓形成后，血管壁和白細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧通過(guò)氧化血栓內(nèi)紅細(xì)胞的血紅蛋白，生成并釋放游離亞鐵血紅素；其具有促炎和氧化作用，能加強(qiáng)炎癥反應(yīng)和凝血之間的相互作用，因此促進(jìn)血液在血栓表面凝固，從而延遲DVT 的溶解；然而這種氧化能力和促炎可被HO-1 中和[8,24]。本研究發(fā)現(xiàn)HO-1 促進(jìn)CRT 溶解過(guò)程中，炎癥因子IL-6水平降低，而抑炎因子IL-10 升高，由此說(shuō)明HO-1的抗炎反應(yīng)可能有助于血栓溶解。而新生血管形成是血栓溶解再通的關(guān)鍵，血栓機(jī)化初期，血栓從血管壁回縮，導(dǎo)致在血栓主體和靜脈壁內(nèi)膜之間形成內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯的口袋樣及裂縫結(jié)構(gòu)，形成新的血管腔并相互融合擴(kuò)大，逐漸恢復(fù)成血栓前狀態(tài)，使堵塞的靜脈恢復(fù)血流[25]。CD31 作為一種黏附性應(yīng)激反應(yīng)蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞連接高表達(dá)，是血管新生的標(biāo)志物，既能維持內(nèi)皮細(xì)胞連接的完整性，又能在炎癥或血栓形成后加速血管通透性屏障的修復(fù)[26]。本研究通過(guò)對(duì)血管組織中的CD31 進(jìn)行檢測(cè)并分析，發(fā)現(xiàn)HO-1 激動(dòng)劑組血栓溶解加快，其CD31 表達(dá)升高，表明誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)可促進(jìn)CRT 溶解再通，其機(jī)制可能與其促進(jìn)新生血管形成功能有關(guān)。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)藥物誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)和基因修飾都能促進(jìn)小鼠心肌梗死后的心肌新生血管生成，最終減輕心肌損傷，改善心功能[27]。近期也有研究表明，HO-1 可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的增殖動(dòng)員及遷移，并聚集至損傷區(qū)域向新生內(nèi)皮細(xì)胞分化，從而促進(jìn)血管修復(fù)并能增強(qiáng)其活力及抗氧化應(yīng)激損傷能力，這可能是HO-1 促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵機(jī)制[28]。因此，HO-1 能促進(jìn)CRT 的溶解再通，可能與抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管新生的功能有關(guān)。

綜上所述，HO-1 是組織細(xì)胞應(yīng)對(duì)損傷性刺激的一種內(nèi)源性適應(yīng)保護(hù)方式，且多項(xiàng)研究均證實(shí)HO-1 在促進(jìn)血栓溶解再通中具有重要作用，可通過(guò)多種途徑和機(jī)制促進(jìn)血栓溶解，其中主要的機(jī)制是HO-1 及其分解產(chǎn)物的抑制炎癥反應(yīng)及促血管新生作用。誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)從而修復(fù)血管，抑制炎癥反應(yīng)已在不同研究中發(fā)現(xiàn)其臨床應(yīng)用價(jià)值，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)水蛭提取物可通過(guò)上調(diào)HO-1 表達(dá)，提高抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激和減輕血管損傷，從而預(yù)防血栓形成[29]；Wu 等[30]表明銀杏葉提取物可誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)對(duì)鋼絲損傷后血管修復(fù)中起關(guān)鍵作用；Zheng 等[31]發(fā)現(xiàn)在血管移植中的PU 管壁內(nèi)加入天麻素，可激活HO-1，具有促進(jìn)血管再生，抑制炎癥的潛力。因此繼續(xù)深入研究HO-1 在血栓溶解再通中促進(jìn)血管生成，抑制炎癥的作用機(jī)制及效果，可能會(huì)為未來(lái)驗(yàn)證HO-1 作為血管修復(fù)和相關(guān)疾病的潛在治療策略的藥理誘導(dǎo)作用提供新的理論基礎(chǔ)。