潘正美,劉 洋

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,昆明 650101)

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF),又稱為早發(fā)性卵巢功能不全( primary ovarian insufficiency, POI),是指女性40 歲之前出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng),月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)至少4 個月,隨機(jī)兩次檢查(間隔>4 周)FSH≥25 IU/L,伴有雌激素水平降低為特征的內(nèi)分泌疾病[1-3]。 近年來,POF 的發(fā)生率每年上升,且不斷向低齡化趨勢發(fā)展,成為中國女性不孕的常見病因之一。 經(jīng)臨床研究證實(shí),POF 不僅會降低女性的生育能力,還會導(dǎo)致圍絕經(jīng)期綜合征、骨質(zhì)疏松、心血管疾病、自身免疫力下降等多種危害[4-5],嚴(yán)重影響女性的身心健康。

POF 的病因十分復(fù)雜,目前已知的病因包括:遺傳因素(染色體異常和基因突變)、自身免疫因素、醫(yī)源性因素(卵巢手術(shù)、放化療損傷)、代謝異常(高半乳糖血癥)、感染和環(huán)境因素等,但大部分的POF 病因尚不明確[6-7]。 POF 病因復(fù)雜,臨床上治療棘手,卵巢功能不可逆轉(zhuǎn),干預(yù)手段效果微乎其微,所以在基礎(chǔ)研究中攻克這個難題尤為重要。 利用動物模型進(jìn)行基礎(chǔ)研究,是研究人類疾病發(fā)生機(jī)制和藥物評價的重要手段。 我們通過建立與POF臨床癥狀病理改變相似的模型,為進(jìn)一步深入探討POF 的發(fā)病機(jī)制,同時為該病的治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。 嚙齒類動物易獲取,飼養(yǎng)方便,成熟早、繁殖快,與人類基因同源性達(dá)到90%,尤其是近交系小鼠遺傳背景明確,被大量應(yīng)用在動物實(shí)驗(yàn)研究中[8]。 根據(jù)POF 不同的發(fā)病機(jī)制,目前已經(jīng)成功構(gòu)建的模型有:基因敲除模型、自身免疫模型、放療模型、化療藥物模型、卵巢切除模型、D-半乳糖模型、以及環(huán)境損傷模型等。

本文將對POF 小鼠模型進(jìn)行綜述,比較各種建模方法的優(yōu)缺點(diǎn),及與臨床的相關(guān)性,旨在為POF的研究提供可靠的動物模型,為臨床進(jìn)一步研究POF 的診療建立基礎(chǔ)。

1 基因敲除POF 模型

染色體異常和基因突變都可以引起POF 發(fā)生,原發(fā)性閉經(jīng)患者染色體異常高于繼發(fā)性閉經(jīng)。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,X 染色體異常是引起POF 的主要病因之一,典型病例就是先天性卵巢發(fā)育不全(Turner 綜合征)[9]。 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了與POF 發(fā)生相關(guān)的基因,包括脆性X 智力低下基因1(FMR1)、骨形成發(fā)生蛋白15 基因(BMP 15)、生長分 化 因 子 9 基 因(GDF9)、 叉 頭 框 L2 基 因(FOXL2)等[10]。

FMR1 基因位于X 染色體上,是遺傳性智力障礙的最常見原因,同時也是原發(fā)性卵巢功能早衰的單基因因素,FMR1 基因突變患者的下丘腦-垂體-卵巢軸的特征和絕經(jīng)患者的表現(xiàn)十分相似,其血清中FSH水平明顯增加,AMH 降低,卵泡閉鎖率增加[11]。FOXL2 是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在顆粒細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,Emori 等[12]發(fā)現(xiàn)敲除雌性小鼠FOXL2 基因后,發(fā)現(xiàn)小鼠顆粒細(xì)胞停止生長,隨后卵母細(xì)胞死亡,大量卵泡閉鎖,生育能力降低;同時發(fā)現(xiàn)FOXL2 對BMP15 具有調(diào)節(jié)作用。BMP15 通過促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育、防止顆粒細(xì)胞凋亡參與促進(jìn)卵泡生長和成熟;BMP15 基因敲除雌小鼠生育能力明顯下降[10]。 通過基因敲除建模能夠明確單個基因的作用,對闡述POF 的機(jī)制有重要的作用。但是一種基因敲除模型只能解釋一個或者某幾個基因,而POF 并不是由某一基因的缺陷或突變導(dǎo)致的。因此,不能完全解釋POF 病因,有其局限性。 基因敲除小鼠模型成本尤其昂貴,難以推廣。

2 自身免疫性POF 模型

研究顯示大約10%~30%的POF 與自身免疫性疾病相關(guān),且近年來由于自身免疫性POF 的發(fā)病率呈升高趨勢。 自身免疫性甲狀腺炎、Addison 病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Ⅰ型糖尿病等與POF 的發(fā)生密切相關(guān)[13]。 自身免疫性POF 在臨床上尤為棘手,其輔助生育結(jié)局往往不良。 因此,自身免疫導(dǎo)致POF,已成為目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。 卵巢是自身免疫攻擊的常見器官之一,隨后表現(xiàn)為卵巢功能障礙,出現(xiàn)POF。 免疫性POF 患者的發(fā)病機(jī)制與抗卵巢抗體(AOA)和免疫性卵巢炎相關(guān)。 有研究顯示,POF 患者外周血T 淋巴細(xì)胞絕對值和比例,尤其是CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分比明顯升高;提示自身免疫性POF 可能是以CD4+T 細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫介導(dǎo)的慢性炎癥[10]。 目前,已經(jīng)有學(xué)者通過切除新生小鼠胸腺和利用透明帶抗原進(jìn)行誘導(dǎo)構(gòu)建自身免疫性POF 小鼠模型。

2.1 新生小鼠胸腺切除誘導(dǎo)

有研究表明摘除3 d 齡新生小鼠的胸腺后可以誘發(fā)自身免疫性卵巢炎,并導(dǎo)致其成年后卵母細(xì)胞完全喪失。 涂曉娟[14]通過摘除新生第3 天BALB/c雌小鼠的胸腺,通過免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)絕大部分的雌小鼠出現(xiàn)了抗卵巢抗體,其卵母細(xì)胞周圍伴隨大量淋巴細(xì)胞浸潤,并出現(xiàn)卵巢萎縮,卵母細(xì)胞破壞,血清LH 和FSH 水平增加,E2水平降低,成功構(gòu)建自身免疫性POF 小鼠模型。 但是給新生小鼠實(shí)行胸腺切除術(shù),操作難度大,死亡率高。

2.2 透明帶(zona pellucida glycoprotein 3, ZP-3)多肽誘導(dǎo)

ZP-3 抗原與自身免疫性POF 的發(fā)生相關(guān),ZP-3多肽可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體,攻擊卵母細(xì)胞,加速卵泡耗竭,導(dǎo)致POF。 Li 等[15]通過腹腔注射75 μg/kg ZP-3 多肽,對7~8 周的BALB/c 雌鼠進(jìn)行第一次免疫,14 d 后,給予同劑量ZP-3 多肽進(jìn)行二次免疫,并在第6 周處死小鼠,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠與對照組比較,其生長發(fā)育變遲緩、反應(yīng)遲鈍、食物攝入減少和體重減輕;與對照組比較,自身免疫性小鼠卵巢間質(zhì)出現(xiàn)大量的淋巴細(xì)胞浸潤,IFN-γ 等炎癥介質(zhì)較高,卵巢有明顯的炎癥改變;自身免疫性小鼠的動情周期發(fā)生紊亂,血清FSH 上升,AMH 和E2水平顯著降低,各階段的卵泡數(shù)量明顯低于對照組,大量卵泡閉鎖,出現(xiàn)了POF 改變;田海清等[16]也使用75 μg/kg ZP-3 腹部皮下注射,誘導(dǎo)BALB/c雌小鼠出現(xiàn)POF,建立自身免疫性POF 小鼠模型。目前自身免疫性POF 模型國內(nèi)外研究報(bào)道逐漸增多,尤其是ZP-3 多肽誘導(dǎo)POF 模型,是常用來探討自身免疫性POF 發(fā)病機(jī)制和病理改變。

3 卵巢切除POF 小鼠模型

卵巢切除模型是研究雌激素缺乏和卵巢功能下降的經(jīng)典模型,常被來研究絕經(jīng)期婦女雌激素的變化和并發(fā)癥,也有學(xué)者用其模擬臨床上卵巢手術(shù)所致的卵巢早衰[17]。 周宇等[18]比較了注射順鉑和切除卵巢兩種方法構(gòu)建POF 小鼠模型,發(fā)現(xiàn)切除雌小鼠的雙側(cè)卵巢后,小鼠的雌激素水平直線下降,動情周期停滯,血清FSH 顯著升高,說明通過切除卵巢能夠構(gòu)建POF 小鼠模型。 同時發(fā)現(xiàn)使用卵巢切除法建模對小鼠的一般生理情況影響較小,其導(dǎo)致的一系列生理病理改變也符合POF 的臨床表現(xiàn),是研究POF 較為理想的動物模型。 切除卵巢建模對小鼠大腦影響的影響較小,適用于研究藥物對POF 小鼠腦功能的影響。 但切除小鼠卵巢后,能引起永久性的卵巢及其激素水平的丟失,無法進(jìn)一步應(yīng)用于POF 臨床治療研究,該建模方法的使用范圍較為局限。

4 通過放療構(gòu)建POF 小鼠模型

放療導(dǎo)致卵巢功能受損是治療女性惡性腫瘤最常見的遠(yuǎn)期副作用之一。 卵巢對放療產(chǎn)生的輻射尤其敏感,特別是原始卵泡。 放療對卵巢的影響主要取決于放療的范圍,盆腔、腹部或脊柱放療發(fā)生卵巢損傷概率相對較高,包括顆粒細(xì)胞凋亡、卵巢皮質(zhì)損害、卵巢萎縮、氧化應(yīng)激等[19]。 POF 是不可逆的,但早期發(fā)現(xiàn)卵巢功能衰竭并及時診斷給以治療可能會延遲甚至改善病情,因此在放療前后對女性生育能力的保存成為了目前臨床上的研究重點(diǎn)。 賀宇恒等[20]模擬臨床放療過程,給予C57BL/6雌小鼠不同劑量X 射線單次全身照射,發(fā)現(xiàn)4 Gy 為最低適宜劑量,照射7~14 d 后可以成功構(gòu)建POF模型。 Tan 等[19]研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組雌小鼠全身單次照射4 Gy 劑量X 射線7 d 后,小鼠的動情周期紊亂,卵巢質(zhì)量下降,各級卵泡數(shù)均減少,血清AMH水平顯著下降。 故通過放療,可以成功建立POF 小鼠模型。 該建模方法成功率高,死亡率低,耗時較短,可重復(fù)性高,能夠模擬臨床放療損傷導(dǎo)致的POF,是較為理想的放療致POF 小鼠造模的方法。

5 使用化療藥物構(gòu)建POF 小鼠模型

近年來,年輕女性惡性腫瘤的發(fā)病率升高,常規(guī)的臨床化療,在治療疾病的同時難免出現(xiàn)卵巢損傷等常見的遠(yuǎn)期副作用[21-24]。 化療藥物可以影響卵泡發(fā)育,造成卵泡閉鎖速率升高,加速卵泡耗竭,引起POF。

5.1 烷化劑類藥物

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)是主要的烷化劑類藥物,主要通過阻止DNA 復(fù)制,誘導(dǎo)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞凋亡引起POF,故可用CTX 誘導(dǎo)構(gòu)建POF 小鼠模型[21-22]。 許冰心[23]和Shen 等[24]采取腹腔注射50 mg/(kg·d) CTX,連續(xù)注射14 d 后,觀察發(fā)現(xiàn)小鼠動情周期紊亂,血清FSH 水平升高,E2和AMH 顯著降低,鏡下觀察小鼠卵巢組織生長卵泡減少,閉鎖卵泡數(shù)目較多,成功構(gòu)建了POF 小鼠模型;Bahrehbar 等[22]給予6~8 周齡C57BL/6 小鼠腹腔注射100 mg/kg Cy,連續(xù)10 d,引起小鼠動情周期紊亂,各個發(fā)育階段的卵泡數(shù)明顯減少,卵巢體積和體重降低,血清FSH 水平增加和E2水平降低,提示建模成功。 CTX 是一種臨床上最常見的化療藥物,采用CTX 構(gòu)建POF 小鼠模型,操作簡單,價格低廉,造模周期短,成功率高且穩(wěn)定,可以用來模擬臨床上環(huán)磷酰胺放療導(dǎo)致卵巢損傷,是經(jīng)典造模方法。

5.2 鉑類藥物

順鉑是臨床上常用來治療腫瘤的鉑類化療藥物,可以抑制細(xì)胞分裂,干擾DNA 修復(fù),引起DNA損傷并觸發(fā)細(xì)胞凋亡,屬于細(xì)胞毒性藥物。 順鉑對卵巢同樣具有毒性作用毒性,其主要損害卵巢皮質(zhì)和顆粒細(xì)胞,誘導(dǎo)卵母細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致卵泡數(shù)減少,加速卵泡閉鎖[21]。 抑制卵巢顆粒細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)其凋亡,并損傷不同發(fā)育階段的卵泡,導(dǎo)致大量卵泡停止發(fā)育,從而引起POF。 趙瑋等[25]研究了不同濃度的順鉑對C57BL/6 小鼠卵巢功能的影響。 發(fā)現(xiàn)1.5 mg/(kg·d)是建立小鼠POF 模型的合適有效濃度,卵巢組織損傷較穩(wěn)定,能夠模擬POF 患者的激素水平變化。 王臻等[26]給予雌性C57/BL6 小鼠腹腔注射順鉑2 mg/(kg·d),連續(xù)注射7 d,成功構(gòu)建POF 小鼠模型。 采用順鉑構(gòu)建POF 小鼠模型的成功率高,操作簡單,模型穩(wěn)定,材料易獲取,是探討化療損傷導(dǎo)致的POF 發(fā)病機(jī)制較好方法,但是順鉑對小鼠體質(zhì)影響較大,全身狀況差,死亡率較高,需要準(zhǔn)確把握順鉑的使用劑量。

5.3 紫杉醇類藥物

紫杉醇在臨床上常用來治療乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌及前列腺癌等,并且取得了顯著的效果,延長年輕女性腫瘤患者壽命。 但有研究顯示紫杉醇可以抑制卵母細(xì)胞的有絲分裂過程,使其發(fā)育停止在M 期,最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡。 趙宏偉[27]研究發(fā)現(xiàn)小鼠對紫杉醇的最大耐受量為120 mg/kg,反復(fù)多次小劑量給藥,20 d 后小鼠血清AMH、E2明顯下降,FSH 升高,建模成功。 但紫杉醇對卵泡生長抑制作用的機(jī)制和對生育功能的影響有待進(jìn)一步研究。

6 D-半乳糖模型誘導(dǎo)POF 小鼠模型

半乳糖血癥是由于1-磷酸半乳糖尿苷轉(zhuǎn)移酶(GALT)缺乏導(dǎo)致,GALT 是乳糖代謝的關(guān)鍵酶,其缺乏會引起的半乳糖代謝紊亂,導(dǎo)致中間產(chǎn)物1-磷酸-半乳糖在患者的肝、腎和腦組織等器官中大量堆積,出現(xiàn)高半乳糖血癥[28-32]。 有研究顯示,高半乳糖血癥最終會發(fā)展為POF,因此可以利用D-半乳糖建立POF 模型。 劉小虎等[29]采用給予BALB/c 雌小鼠頸背部皮下注射35%D-半乳糖200 mg/(kg·d),連續(xù)給藥42 d 后,小鼠動情周期改變;尹郭偉[30]和Liu等[31]選取7~8 周齡C57BL/6 雌小鼠,腹腔注射同劑量的35% D-半乳糖溶液,連續(xù)注射8 周,期間通過每日陰道涂片和顯微鏡檢測小鼠動情周期,發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)情周期延長,安樂死處死小鼠后解剖發(fā)現(xiàn)小鼠的雙側(cè)卵巢發(fā)生萎縮,血清FSH 水平較對照組明顯升高,血清E2、AMH 水平降低,提示建模成功。 采用D-半乳糖造模,其優(yōu)點(diǎn)是方法簡單、材料易獲取、價格低廉、成功率較高,可以使動物出現(xiàn)POF 典型臨床癥狀,但是高半乳糖血癥在臨床中發(fā)病率很低,缺乏實(shí)用的臨床意義,不具有代表性,最終結(jié)果是否能指導(dǎo)臨床,有待進(jìn)一步研究。

7 職業(yè)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)VCD 構(gòu)建POF 小鼠模型

在工業(yè)生產(chǎn)橡膠輪胎、阻燃劑、殺蟲劑等過程中常產(chǎn)生4-乙烯基環(huán)己烯雙環(huán)氧化物(VCD)。 有研究報(bào)道VCD 可以通過破壞雌鼠的原始卵泡和初級卵泡,引起小鼠卵泡耗竭,進(jìn)而發(fā)生POF。 Cao等[33]通過給予雌小鼠連續(xù)15 d 腹腔注射160 mg VCD 誘導(dǎo)構(gòu)建POF 模型。 在VCD 注射15 d 后,小鼠卵巢的原始卵泡和初級卵泡明顯減少,25 d 幾乎沒有次級卵泡,35 d 成熟卵泡幾乎完全耗盡,45 d小鼠的動情周期紊亂,發(fā)情時間延長,FSH 保持較高水平,E2和AMH 顯著下降。 生育實(shí)驗(yàn)中使用VCD 誘導(dǎo)POF 小鼠模型,其妊娠率沒有明顯改變,但是需要多配偶交配才能成功受孕,說明雌小鼠受孕能力出現(xiàn)下降。 所以用VCD 誘導(dǎo)能夠成功構(gòu)建POF 小鼠模型,此方法操作簡單,成功率高,但是建模周期長,可適用于研究環(huán)境因素導(dǎo)致女性POF。

8 總結(jié)和展望

綜上所述,闡明POF 的發(fā)病機(jī)制在POF 的臨床治療至關(guān)重要。 動物模型能夠闡明疾病的病理生理機(jī)制,幫助我們更好研究POF。 雌小鼠發(fā)情周期與女性相似,但時間比人類短,是構(gòu)建POF 模型的理想動物。 目前,POF 小鼠模型的幾種方法建模中,放化療模型會導(dǎo)致卵巢不可逆損傷,此類方法造模時間短,成功率高,但是會損傷其他的臟器組織,造成小鼠死亡;手術(shù)切除卵巢模型可以模擬醫(yī)源性卵巢損傷,手術(shù)成功率高,但是此模型只能模擬POF 的終末階段,無法用于研究和評價POF 的臨床干預(yù)療效;自身免疫性POF 通過注射ZP3,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體,損害免疫系統(tǒng)和卵巢來建模,但其應(yīng)用范圍有限;利用半乳糖誘導(dǎo)高半乳糖血癥構(gòu)建POF 模型方法簡單,但是其在臨床上發(fā)病率低,缺乏實(shí)用的臨床意義;最后,基因敲除模型使用逐漸增多,可以模擬遺傳缺陷導(dǎo)致的POF,明確特定基因缺失的意義,將來有望成為趨勢。 各種POF 小鼠模型構(gòu)建方式針對不同病因都有其優(yōu)勢和缺陷(見表1)。 應(yīng)根據(jù)具體的研究條件及目的進(jìn)行選擇。 由于POF 的發(fā)病機(jī)制不明確,臨床治療棘手,因此成功建立POF 模型顯得十分重要,但目前缺乏構(gòu)建POF 模型的標(biāo)準(zhǔn)。 此外,目前關(guān)于POF 的研究,主要是使用嚙齒類動物來進(jìn)行建模,但嚙齒類動物與人類遺傳背景、生理及代謝特征等方面的差異很難體現(xiàn)人類疾病的復(fù)雜癥狀。 因此,構(gòu)建更符合人類遺傳背景POF 動物模型,如樹鼩、食蟹猴等受到國內(nèi)外專家的廣泛重視,如楊鳳等[34]通過切除雌性樹鼩雙側(cè)卵巢成功構(gòu)建了POF 模型,陳剛等[35]切除雌性食蟹猴的雙側(cè)卵巢誘導(dǎo)構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型,此類模型為今后臨床進(jìn)一步研究POF 提供重要的基礎(chǔ)。

表1 各種常見POF 小鼠建模方案比較Table 1 Comparison of various common POF mouse modeling schemes