賴成霞，瑪依拉·玉素音，石必顯，李春平，姜夢竹，鄭子漂，楊 棟

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.新疆維吾爾自治區(qū)植物保護(hù)站，烏魯木齊 830049)

0 引 言

【研究意義】棉花黃萎病是危害棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的重要障礙性因素，由于其致病菌大麗輪枝菌存在多種形式的初侵染源，并且具有變異快等特點，造成培育抗病品種、使用化學(xué)藥劑和利用新的栽培技術(shù)等方法防病效果均不理想。篩選出高效抗病的植物誘抗劑、殺菌劑與助劑激健的組方及合理的施用措施，對棉花黃萎病防治中化學(xué)農(nóng)藥的減量增效具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉花黃萎病(cottonVerticilliumwilt)是由大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)[1]侵染而發(fā)生的一種土傳維管束真菌病害，是新疆棉區(qū)危害最為嚴(yán)重的病害之一，該病原菌不僅能侵染棉花，而且還能侵染茄子、番茄、土豆等多個物種[2]，茄黃萎病初侵染源實驗表明，土壤、植物病殘體、種子中的微菌核以及厚垣孢子和休眠菌絲均可成為該病的初侵染源[3,4]，而在棉花中，微菌核是該病在土壤中的主要結(jié)構(gòu)及初侵染源，是棉花黃萎病發(fā)病的主要原因，其侵染過程產(chǎn)生的菌絲或孢子，進(jìn)入棉花的維管系統(tǒng)，大量菌絲和孢子的繁殖刺激鄰近薄壁細(xì)胞產(chǎn)生膠狀物或侵填體堵塞導(dǎo)管，導(dǎo)致水分和養(yǎng)分運(yùn)輸困難，使植株發(fā)生萎蔫、黃化等。并且該病可通過多種途徑進(jìn)行傳播和重復(fù)侵染，如羊糞[5]，棉花種子外被的短絨、植物病殘體及土壤[6]。前期研究者將多個藥物進(jìn)行有效復(fù)配可有效防治棉花黃萎病，如奇農(nóng)素與多菌靈進(jìn)行種子脫毒處理后用60%3911和衛(wèi)福包衣劑包衣,再利用奇農(nóng)素和多菌靈、農(nóng)用鏈霉素、硫酸銅混合液進(jìn)行灌根和葉面噴施處理可有效防控棉花黃萎病[7]；多菌靈與芽孢菌“B908”混用防治棉花黃萎病，效果大于單用多菌靈[8]；隨著科研水平的長足發(fā)展，提高棉花自身的防御體系的誘抗劑也成為棉花黃萎病防治的有效措施之一，如3%氨基寡糖素寡糖，在棉花黃萎病發(fā)病初期進(jìn)行葉面噴霧,能有效防治棉花黃萎病，防效高達(dá)54%[9]。【本研究切入點】大麗輪枝菌不僅變異速度快而且微菌核具有較強(qiáng)的抵御逆境的能力，防治困難。從培育抗病品種、單一使用化學(xué)藥劑和生物防治技術(shù)等多個方面入手，但防病效果均不理想，以提高藥物的利用率，有效抑制病原菌萌發(fā)及生長，提高植物自身免疫系統(tǒng)的綜合防治策略成為研究的熱點，在生產(chǎn)中，菌/藥組合、藥/藥以及植物誘抗劑組合在棉花黃萎病防治上均起到了重要作用，但其化學(xué)農(nóng)藥的施用也對環(huán)境安全造成影響，但當(dāng)黃萎病病原菌侵入植株體內(nèi)后，化學(xué)藥劑、生物制劑能進(jìn)入植物體內(nèi)的含量很低，仍需加大施藥劑量才能將病害防治在經(jīng)濟(jì)閾值以下。篩選出能增加植物體內(nèi)有效農(nóng)藥含量但又不加大實際農(nóng)藥施用劑量的增效劑，則成為棉花黃萎病藥劑減施增效的一個有效措施?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過將化學(xué)農(nóng)藥多菌靈、乙蒜素，生物菌劑枯草芽孢桿菌，增效劑激健進(jìn)行優(yōu)化組合配方，并對黃萎病致病菌V991菌絲進(jìn)行菌絲生長速率實驗，篩選出激健對V991菌絲顯著增效的殺菌劑，采用盆栽黃萎病試驗，研究誘抗劑、藥/激健的施用措施和施用方法，為新疆棉花黃萎病防治中化學(xué)農(nóng)藥的減施增效提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病原菌

棉花黃萎病病原菌-大麗輪枝菌V991(VerticilliumdaliaeKleb)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)院朱龍富課題組提供。

1.1.2 棉花品種

供試棉花品種為冀棉11，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.3 供試藥劑

63%激健可溶性助劑，成都激健生物科技有限公司；50%多菌靈可濕性粉劑，威海韓孚生化藥業(yè)有限公司；80%乙蒜素乳油，海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司；20.02億/mL枯草芽孢桿菌液體，威遠(yuǎn)生化；5%氨基寡糖素水劑，海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司；PDA培養(yǎng)基(Oxoid公司)。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

培養(yǎng)棉花黃萎病菌絲、孢子的固體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，培養(yǎng)大量孢子的液體培養(yǎng)基-查氏(Czapek)培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基按照生產(chǎn)商提供的方法配制，即1 L水中加入39 g PDA干粉，煮沸完全溶解后，121℃高壓滅菌15 min，再倒板；查氏(Czapek)培養(yǎng)基：1 L水中加入葡萄糖30 g，NaNO32 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，完全溶解后，121℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 棉花黃萎病病原菌株的分離培養(yǎng)

供試使用的大麗輪枝菌V991是以孢子的形式儲存在-80℃冰箱中，為確保實驗的準(zhǔn)確性，將病原菌進(jìn)行活化分離，利用毛細(xì)管制成接種針劃板，分離獲得病原菌單個孢子，由單個孢子產(chǎn)生分離出菌絲型、菌核型及孢子型的病原菌，菌絲型的病原菌株用于進(jìn)行殺菌劑的毒力測定實驗，孢子型的病原菌株用于盆栽防治效果實驗。

1.2.3 棉花黃萎病病原菌株致病力的鑒定

選用孢子型的大麗輪枝菌進(jìn)行致病力測定，先將該菌在25℃下在PDA平板上培養(yǎng) 10～14 d培養(yǎng)，在菌落邊緣區(qū)域，用直徑5 mm的無菌打孔器制成菌餅備用，將2葉期的棉花，用70%的乙醇消毒1 min后，在葉背面用消毒針針刺葉面20下，再將菌餅面朝下放置在針刺部位，對照采用無菌的菌餅進(jìn)行處理，所有試驗均在含有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行，溫度25℃，弱光培養(yǎng)，10 d后觀察病斑大小。

1.2.4 病原菌接種液制備

選取鑒定到的強(qiáng)致病力的孢子型大麗輪枝菌在PDA (Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基上25℃下培養(yǎng) 7～10 d，在菌落邊緣區(qū)域，用直徑5 mm 無菌打孔器將其菌落制成菌餅，將 4片菌餅加到盛有200 mL Czapek培養(yǎng)基的三角瓶(500 mL)中，在25℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d。然后過400目鋼篩，常溫，10 000 g離心5 min，將獲得的沉淀加入純凈水，制得病原菌分生孢子懸浮液，應(yīng)用血球計數(shù)板檢測其中病原菌分生孢子含量,并用將分生孢子的含量稀釋為 107mL/L的懸浮液，作為病原菌接種液。

1.2.5 病原菌接種

當(dāng)棉苗生長到 2～3 片真葉時，采用傷根共培養(yǎng)的接種方式進(jìn)行病原菌接種。 將棉苗自營養(yǎng)缽中取出，用無菌剪刀在距根尖 1.5 cm處剪斷棉根，再放回原來的營養(yǎng)缽,保持土壤濕度為100%，再接入20 mL 107孢子懸浮液,將接入20 mL的純凈水作為健康對照，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)10株苗。

1.2.6 棉苗準(zhǔn)備及栽培

選取健康、飽滿的棉花種子，用70%乙醇處理1 min，再用15%過氧化氫消毒處理3～4 h，最后用去離子水沖洗3～4遍，在28℃下催芽24 h至種子露白，植入穴盤，土壤中蛭石與營養(yǎng)土的比例為2∶1， pH值6.3，放入溫室中生長，溫度28℃，光/暗周期14 h/10 h，待子葉完全展開后將苗移栽至營養(yǎng)缽中，至苗生長至三葉期用于盆栽黃萎病防治試驗，將溫度在25℃左右，始終保持棉苗在低溫高濕的條件生長。苗生長期所用的水均為去離子水。

1.2.7 殺菌劑/助劑的抑菌效果測定

采用生長速率法測定3種單一殺菌劑及3種殺菌劑/助劑組合對大麗輪枝菌V991菌絲的抑制作用。采用雙因素試驗設(shè)計，因素1為6種藥劑及組合，因素2為藥劑濃度，多菌靈設(shè)置5個濃度，分別為20、50、66.7、100、200 mg/kg，乙蒜素設(shè)置5個濃度，分別為2.5、5、10、20、50 mg/kg，枯草芽孢桿菌設(shè)置為2個濃度，分別為5、10 mg/kg，在PDA培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的6種殺菌劑混合制成含藥培養(yǎng)基平板，以添加等量無菌水的 PDA培養(yǎng)基為對照，各3次重復(fù)。用打孔器在供試菌株菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，將其接種到含藥平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑(mm)，取其平均值，計算各藥劑濃度對菌絲生長的抑制率。

抑菌率=[對照菌直徑-處理菌落)/(對照菌落直徑-5)]×100%。

將藥劑濃度換算成濃度對數(shù)(x)，菌絲生長抑制率換算成抑制機(jī)率值(y)，計算各藥劑的抑制中濃度EC50。

1.2.8 不同藥/助劑組合對大麗輪枝菌V991的盆栽棉花黃萎病防治效果

設(shè)置多菌靈濃度為50 mg/kg，乙蒜素濃度為5 mg/kg，助劑激健濃度為33 mg/kg，誘抗劑氨基寡糖素濃度為20 mg/kg，誘抗劑的施藥方法設(shè)置為施藥后接種和先接種后施藥2種方式，第1次施藥分別在接種病原菌前24 h和接種后24 h進(jìn)行；同時設(shè)置不同的藥/藥/助劑/誘抗劑組合，組合1為多菌靈/激健-乙蒜素/激健，組合2為乙蒜素/激健-多菌靈/激健，組合3為多菌靈-乙蒜素，組合4為乙蒜素-多菌靈，上述組合的施藥方式為分次依序施藥，并設(shè)置噴施等量清水作為空白對照。在棉花葉片長至2～3葉期，進(jìn)行根部接菌，其他不同藥劑組合在對照葉片顯示病癥起進(jìn)行噴藥處理，共噴施2次藥，在噴施第1種藥后第3 d開始噴施第2種藥，使用手動噴霧器施藥，以葉面均勻噴施藥劑至剛好有藥液滴下為標(biāo)準(zhǔn)。第1次病情調(diào)查在接種后14 d進(jìn)行，第2次調(diào)查在第2次施藥后28 d進(jìn)行，共調(diào)查2次。采用全株調(diào)查法進(jìn)行統(tǒng)計，分別記載病葉數(shù)及其病級，計算每個處理的病情指數(shù)及防治效果。

1.2.9 病情指標(biāo)

每次施藥前調(diào)查棉花黃萎病的病情指數(shù)，調(diào)查時以株為單位，采用全面調(diào)查法，對所有處理的棉花的葉片進(jìn)行調(diào)查，病害分級標(biāo)準(zhǔn)為0級：供試棉花全株無病，葉片無病斑；1級：供試棉花葉片病斑面積占整個葉面積的5%及以下視為一級；3級：供試棉花葉片病斑面積占整株葉面積的6%～11%視為三級；5級：供試棉花葉片病斑面積占整株葉面積的13%～21%視為五級；7級：供試棉花葉片病斑面積占整株葉面積的22%～41%視為七級；9級：供試棉花葉片病斑面積占整株葉面積的42%～61%視為九級；11級：供試棉花葉片病斑面積占整株葉面積的62%～81%視為十一級；13級：供試棉花葉片病斑面積占整株葉面積的82%及以上視為十三級。計算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=Σ(各級病株數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級值)×100。

防治效果=[1-(對照區(qū)施藥前病情指數(shù)×處理區(qū)施藥后病情指數(shù))] /(對照區(qū)施藥后病情指數(shù)×處理區(qū)施藥前病情指數(shù))×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理、分析運(yùn)用Excel 2010，插圖繪制運(yùn)用Photoshop 2017。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麗輪枝菌V991的分離及致病力鑒定

研究表明，共分離到了菌絲型、孢子型以及菌核型3種類型的大麗輪枝菌株，這3種菌落在PDA平板上均為圓形，其中菌絲型、孢子型的菌落邊緣整齊，菌絲為白色，菌核型菌落內(nèi)部黑化，邊緣白色但不規(guī)則，菌絲型的菌落菌絲較為長且茂密，而孢子型的菌落菌絲短且其上長有大量分生孢子，顯微鏡觀測菌絲型菌落的菌絲形態(tài)呈輪枝狀，孢子型菌落的分生孢子呈長橢圓形，無色，盡管孢子型菌落的菌絲顏色、外形都比較整齊，但其分生孢子的形態(tài)、大小還具有差異，對孢子型的菌株又進(jìn)行了進(jìn)一步分離，共獲得12個菌株，采用刺傷接種法將含有各菌株的菌餅回接到二葉期的棉花葉片上，以無菌的PDA菌餅為對照，10 d后各菌落均可產(chǎn)生病斑，其中2號菌落N2,7號菌落N7產(chǎn)生的病斑與對照相比明顯重，并且N2的病斑面積明顯大于N7的病斑面積，菌株N2的致病力明顯高于其他菌株。圖1

圖1 大麗輪枝菌V991的分離及對棉花葉片致病力鑒定Fig.1 Isolation of Vercillium dahliae V991 and identification of the pathogenicity on the cotton leaves

2.2 不同助劑對大麗輪枝菌菌絲生長的影響

研究表明，在自來水，純凈水以及超純水配制形成的PDA平板上，各處理菌絲均生長良好，并且各處理中菌絲直徑無明顯差異，而由不同濃度助劑激健配制的PDA平板上，各處理菌絲生長卻均存在較大差異，在無藥PDA培養(yǎng)皿(CK)中的菌絲形態(tài)與含有激健3 000倍液、4 000倍液的PDA培養(yǎng)皿相比，大麗輪枝菌V991菌絲形態(tài)正常，而含有激健1 000倍液培養(yǎng)皿中的菌絲則呈現(xiàn)明顯的發(fā)育不良，菌絲直徑降低的情況，激健4 000、3 000、2 000倍液對菌絲的發(fā)育雖然也有一定的影響，但這3個處理對菌絲直徑的影響無明顯差異，不論任何來源的水，均對大麗輪枝菌菌絲的生長無影響，而激健4 000、3 000、2 000、1 000倍液均對菌絲生長具有抑制作用，其中1 000倍液的抑制作用最強(qiáng)。圖2

2.3 不同殺菌劑添加助劑后對大麗輪枝菌V991的抑菌效果

研究表明，各殺菌劑添加激健后，大麗輪枝菌的菌絲形態(tài)、菌落直徑、菌絲顏色均發(fā)生了明顯變化，其中多菌靈、乙蒜素，隨著殺菌劑/激健劑量的不斷增加，菌絲直徑不斷降低，菌絲發(fā)育狀況也不斷降低，菌絲顏色也由最初的白色逐漸變?yōu)辄S白色，而枯草芽孢桿菌則在添加激健后，其菌絲直徑并未減小，相反菌絲形態(tài)也呈現(xiàn)不規(guī)則狀，并且在PDA平板上還有大量雜菌出現(xiàn)，激健并不能充當(dāng)枯草芽孢桿菌的助劑。添加激健后多菌靈、乙蒜素對菌絲直徑的抑制率也顯著提高，多菌靈的EC50也由最初的1.707 mg/kg降低至0.104 mg/kg，農(nóng)藥劑量降低了16.4倍，乙蒜素的EC50也由最初的1.249 mg/kg降低至0.824 mg/kg，農(nóng)藥劑量也降低了1.5倍，由此可見，激健可作為多菌靈、乙蒜素的增效劑，可顯著提高對大麗輪枝菌V991菌絲的生長速度。圖3

圖3 大麗輪枝菌V991在不同殺菌劑與殺菌劑/激健處理下的菌落形態(tài)及抑菌率Fig.3 Colony morphology and antibacterial rate against Vercillium dahlia V991with different concentrations fungalcide and fungalcide/Jijian treatments

2.4 不同殺菌劑添加激健和氨基寡糖素對棉花黃萎病的盆栽防治效果

研究表明，無論是接菌前還是接菌后施用氨基寡糖素，多菌靈/激健-乙蒜素/激健交替施藥組合的防治效果最好，其28 d后的防治效果分別可達(dá)69.27%和62.70%，但接種前施用誘抗劑的，其14與28 d的防效相比出現(xiàn)先高后低的情況，而接種后施用誘抗劑的防效情況則與此相反。而其他乙蒜素/激健-多菌靈/激健式，多菌靈-乙蒜素，乙蒜素-多菌靈這3種施藥方式對棉花黃萎病V991幾乎毫無防治效果，合理的施用殺菌劑與激健的組合是能有效控制黃萎病的發(fā)生。表1

注；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

表1 接種病原菌前后24 hr施用誘抗劑對盆栽黃萎病的防治效果Table 1 Control effect of fungicides against potted cotton Vercillium wilt with spraying inducer 24h before or after inoculating pathogen

3 討 論

藥劑防治是棉花黃萎病防治的主要措施之一，如多菌靈[10]，乙蒜素[11]，枯草芽孢桿菌[12-14]，在農(nóng)田使用中50%的多菌靈使用濃度高達(dá)500倍液，并且防治效果也不佳，80%乙蒜素乳油1 500倍液的防效也才達(dá)到38.65%，并且為提高藥劑對黃萎病的防治效果，采用生物菌與化學(xué)農(nóng)藥、植物誘抗劑結(jié)合使用的方式，可極大的提高黃萎病的防治效果，如乙蒜素1 500倍液與茉莉酸甲酯50 μg/mL及枯草芽孢桿菌為43.3×105/mL時，防效可達(dá)54.25%。

研究綜合前人研究結(jié)果，以生產(chǎn)中常用的多菌靈、乙蒜素等化學(xué)農(nóng)藥為研究對象，利用助劑激健作為增效劑，可顯著增加多菌靈、乙蒜素對大麗輪枝菌V991菌絲生長的抑菌率，50 mg/kg多菌靈的抑菌率由原來的19.68%提高至35.49%，5 mg/kg乙蒜素的抑菌率也由原來的14.83%提高至26.29%，并且添加激健后多菌靈的EC50由原來的1.707 mg/kg降低至0.104 mg/kg，其藥劑施用量降低了16.41%，乙蒜素添加激健后其EC50也由原來的1.249 mg/kg降低至0.824 mg/kg，藥劑施用量也降低了1.52倍，由于不同病原菌的菌株之間對藥劑存在敏感性差異現(xiàn)象[15, 16]，并且藥劑在不同植物中的也存在滲透和傳導(dǎo)性差異，研究在盆栽黃萎病防治實驗中采用了交替施藥，避免抗性產(chǎn)生的策略，植物誘抗劑與多菌靈/激健-乙蒜素/激健組合對棉花黃萎病有最佳的防治效果，與單因素相比防效有了顯著提高，并且無論是接種前還是接種后施用誘抗劑，多菌靈/激健-乙蒜素/激健交替施藥組合的防治效果最好，其28 d后的防治效果仍可高達(dá)69.27%和62.70%，試驗表明，以將植物誘導(dǎo)劑和殺菌劑/激健交替施藥防治棉花黃萎病是可行的。但由于試驗僅為苗期篩選試驗，其施用方式、施用時間、防病機(jī)理以及大田防病效果仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

激健可作多菌靈、乙蒜素的增效劑，可顯著增加其對大麗輪枝菌V991菌絲生長的抑制率，但是其對生物菌藥枯草芽孢桿菌無效；無論接菌前還是接菌后噴施氨基寡糖素，菌靈/激健-乙蒜素/激健交替施藥組合對棉花黃萎病防治效果最佳。