塔里木裂腹魚人工繁殖、胚胎發(fā)育和早期仔魚發(fā)育研究

趙年樺,徐 筱,趙 賀,溫子政,劉茂春,胡仁云,聶竹蘭

(1.塔里木大學 動物科學學院,新疆阿拉爾 843300;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室,新疆阿拉爾 843300;3.塔里木珍稀魚類研究中心,新疆阿拉爾 843300;4.武漢中科瑞華生態(tài)科技股份有限公司,武漢 430000)

塔里木裂腹魚(Schizothorax bid dulphi)隸屬于鯉形目(Cypriniformes),鯉科(Cyprinidae),裂腹魚亞科(Schizothoracinae),裂腹魚屬(Schizothorax),是新疆的特種魚類,因此被漁民稱為“新疆魚”,目前僅分布于新疆維吾爾自治區(qū)塔里木河水系,是塔里木河流域最具代表性的魚類之一[1]。20世紀50年代,其種群數(shù)量曾在博斯騰湖達到最大值,占漁獲物組成的80%,一度成為該湖最重要的經(jīng)濟魚類之一[2]。20世紀70年代前后,塔里木裂腹魚由于自身條件的限制,例如生長力度緩慢、性成熟晚、繁殖力低下以及對產(chǎn)卵場所和生活條件要求較高等,再加上人為條件和自然環(huán)境的約束,例如興修水庫、開墾荒地等,導致塔里木裂腹魚的生存棲息地遭到嚴重迫害,因而種質(zhì)資源和數(shù)量急劇減少[3],現(xiàn)博斯騰湖已無該魚種,僅在塔里木河水系的渭干河、阿克蘇河、和田河、克孜勒河、車爾臣河、葉爾羌河中存留,且數(shù)量極少。塔里木裂腹魚在1998年作為新疆二級保護野生動物被收錄于《中國瀕危動物紅皮書》[4],2004年被新疆維吾爾自治區(qū)列為II類水生保護動物,是中國特有的重要的珍稀魚類之一[5]。

對瀕危魚類進行人工繁育與增殖放流,是保護該魚類免遭滅絕的重要措施。此前,張人銘等[6]對新疆阿克蘇河(Aksu River)的塔里木裂腹魚進行人工繁殖試驗,并其胚胎發(fā)育進行描述,龔小玲等[7]對新疆車爾臣河(Qarqan River)的塔里木裂腹魚的胚胎和1～22 d仔魚發(fā)育進行描述,二者均未對塔里木裂腹魚出膜方式以及人工催產(chǎn)藥物劑量進行研究。本試驗于2020年將新疆克孜勒河(Kizil River)捕撈的野生塔里木裂腹魚作為親本,探究最佳人工催產(chǎn)藥物濃度并對其胚胎發(fā)育和1～36 d仔魚生長進行詳細觀察,進一步豐富塔里木裂腹魚早期生活史,為其保護及增殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點及親魚來源

繁殖用塔里木裂腹魚親魚于2018年1-12月、2019年1-12月捕自克孜勒河流域,共捕獲野生親本1 365尾,其中體長為159.33～245.29 mm,體質(zhì)量為65.34～170.02 g。試驗于2020年4-6月在新疆察汗烏蘇魚類增殖站進行,選擇雄性塔里木裂腹魚親魚為3+以上,雌性塔里木裂腹魚親魚為4+以上,雌雄親魚比例1∶2,養(yǎng)殖于循環(huán)水養(yǎng)殖池中(規(guī)格≥20 m3水深≥0.8 m、溶氧≥5 mg/L),期間投喂斯特徍生物活性飼料T2、T3,日投餌率為3%～5%。

1.2 人工催產(chǎn)

試驗用魚為健康雌魚,共計960尾。采用顯著性檢驗和響應(yīng)面法,探究鯉魚腦垂體(Pituitary gland,PG)、馬來酸地歐酮(Domperidone,DOM)和促黃體素釋放激素A2(Luteinizing hormone releasing hormone A2,LRH-A2)對塔里木裂腹魚催產(chǎn)效果的單項調(diào)控和復(fù)合項調(diào)控作用。以PG、DOM、LRH-A2為催產(chǎn)劑,參照厚唇裂腹魚(Schizothorax irregularis)[8]和細鱗裂腹魚(Schizothorax chongi)[9]催產(chǎn)藥物所需藥量,設(shè)置各催產(chǎn)劑用量梯度。其中PG用量梯度為5、10、15、20和25 mg/kg;DOM用量梯度為5、10、15、20和25 mg/kg;LRH-A2用量梯度為10、15、20、25和30μg/kg。每個單項調(diào)控試驗中設(shè)置3個試驗組,每組10尾雌魚。進行3種催產(chǎn)藥物復(fù)合項調(diào)控試驗時,采用3因素1水平的Box-Benhnken試驗設(shè)計,因子水平分別為-1、0、1,試驗點共17個,每個試驗點共設(shè)置3組重復(fù)試驗,每10尾雌魚。通過試驗結(jié)果分析建立塔里木裂腹魚催產(chǎn)率(Y)與PG(A)、DOM(B)和LRH-A2(C)因素間的多元線性回歸方程。

所有雌魚進行催產(chǎn)時均采用胸鰭基部注射2針法,第1針注射總量的1/5,間隔12 h后,將剩下的4/5藥量全部進行注射。整個試驗用水為經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)過濾的地下水,水溫為(16.5±0.5)℃,p H為8.45～8.56,溶解氧為3.5～3.7 mg/L,鹽 度 為0.17%～0.19%,氨 氮＜0.1 mg/L。

1.3 人工授精及孵化

采用干法進行授精。將受精卵均勻鋪放在孵化框中(0.50 m×0.40 m×0.35 m),并放入孵化池中(5.00 m×0.45 m×0.50 m),采用淋浴式孵化法[8]進行孵化,水溫變化控制在16.0～16.5℃,溶解≥8.0 mg/m L。

1.4 胚胎發(fā)育和早期仔魚發(fā)育觀察

選取同批次50粒受精卵進行胚胎發(fā)育觀察研究,利用SMZ 1270數(shù)碼體式顯微鏡觀察受精卵發(fā)育各時期,以70%的受精卵進入相同發(fā)育時期作為一個發(fā)育期的判定;選取同批次受精卵發(fā)育出膜的仔魚用于早期仔魚發(fā)育觀察研究,每次選取至少10條仔魚,采用10%福爾馬林溶液固定,在鏡下進行觀察記錄并參照龔小玲等[7]劃分仔魚發(fā)育時期的方法進行塔里木裂腹魚仔魚發(fā)育時期的確定。

1.5 孵化效率評價

根據(jù)下列公式,計算塔里木裂腹魚催產(chǎn)率、受精率和孵化率。

催產(chǎn)率=產(chǎn)卵尾數(shù)/催情總尾數(shù)×100%

受精率=原腸中期活卵數(shù)/產(chǎn)卵總數(shù)×100%

孵化率=魚苗水花尾數(shù)/受精卵總數(shù)×100%

1.6 數(shù)據(jù)處理

卵徑及各發(fā)育階段的仔魚全長的數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”來表示。探究催產(chǎn)劑對塔里木裂腹魚催產(chǎn)效果的單項調(diào)控和復(fù)合項調(diào)控作用時,其催產(chǎn)率結(jié)果使用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析,采用Duncan’s法進行多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 對塔里木裂腹魚催產(chǎn)率的單獨調(diào)控結(jié)果

圖1所示,在5～25 mg/kg PG用量區(qū)段間,塔里木裂腹魚催產(chǎn)率隨著用量上升而出現(xiàn)先增加后減少的趨勢,在PG用量為10 mg/kg條件下,催產(chǎn)率達到最高,為(26.67±0.06)%;同樣,在5～25 mg/kg DOM用量區(qū)段間,塔里木裂腹魚催產(chǎn)率隨著用量上升而同樣出現(xiàn)先增加后減少的趨勢,在DOM用量為15 mg/kg條件下,催產(chǎn)率達到最高,為(26.67±0.15)%;圖2所示,當LHR-A2用量為25μg/kg時,塔里木裂腹魚催產(chǎn)率達到最高,為(23.33±0.06)%。

2.2 最佳催產(chǎn)藥物濃度篩選

響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表1。塔里木裂腹魚催產(chǎn)率(Y)與PG(A)、DOM(B)和LRHA2(C)因素間的多元線性回歸方程為Y=-29.42A2-36.08B2-24.42C2-4.17AB+7.50AC+4.17BC-8.33A+1.67B-2.50C+78.00?；貧w模型決定系數(shù)R2為0.993 5,校正系數(shù)R2Adj為0.985 2,表明試驗誤差較小;模擬失效項P為0.568 4(P＞0.05),且根據(jù)PG、DOM和LRH-A23種因素對塔里木裂腹魚催產(chǎn)率調(diào)控的響應(yīng)面結(jié)果顯示,PG和DOM、PG和LRHA2、DOM和LRH-A2對響應(yīng)值(Y)的交互作用均呈開口向下的山丘狀,二維等高線近圓形(圖3),說明模型有效,可以很好分析和預(yù)測三種催產(chǎn)藥物對塔里木裂腹魚催產(chǎn)率的效果。本試驗響應(yīng)模型的優(yōu)化結(jié)果顯示,PG在13.47 mg/kg、DOM在15.27 mg/kg和LRH-A2在19.28μg/kg,此時塔里木裂腹魚催產(chǎn)率理論值最高,為78.75%。經(jīng)過驗證,最優(yōu)催產(chǎn)藥物濃度下塔里木裂腹魚催產(chǎn)率為(76.67±0.06)%,結(jié)果與理論催產(chǎn)率基本相符,說明響應(yīng)模型方程可有效預(yù)測塔里木裂腹魚催產(chǎn)率。

表1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果(±s)Table1 Response surface design and results

表1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果(±s)Table1 Response surface design and results

試驗組Group編碼值Code value(mg/kg)B-DOM/(mg/kg)C-LRH-A 2/(μg/kg)A-PG/催產(chǎn)率/%Induced spawning rate 1 1(25) 0(15) 1(30) 20.00±0.10 2 0(15) 0(15) 0(20) 73.33±0.06 3 0(15) 0(15) 0(20) 76.67±0.06 4 -1(5) 1(25) 0(20) 26.67±0.06 5 0(15) 1(25) 1(30) 23.33±0.06 6 0(15) 1(25) -1(10) 16.67±0.06 7 1(25) 1(25) 0(20) 0.00±0.00 8 0(15) 0(15) 0(20) 76.67±0.06 9 0(15) -1(5) 1(30) 10.00±0.10 10 1(25) -1(5) 1(20) 6.67±0.06 11 -1(5) 0(15) 1(30) 20.00±0.10 12 1(25) 0(15) -1(10) 13.33±0.06 13 0(15) 0(15) 0(20) 83.33±0.06 14 0(15) 0(15) 0(20) 80.00±0.10 15 -1(5) -1(5) 0(20) 16.67±0.06 16 0(15) -1(5) -1(10) 20.00±0.00 17 -1(5) 0(15) -1(10) 43.33±0.11

2.3 塔里木裂腹魚胚胎發(fā)育

胚胎發(fā)育包括早期胚胎發(fā)育(受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚期、胚孔閉合期)以及器官發(fā)生(肌節(jié)出現(xiàn)期、眼囊期、耳囊期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心跳期、出膜期)共14個時期(圖4),在水溫19～19.2℃條件下,歷時93 h 36 min發(fā)育為仔魚,總積溫為1 785.24℃·h(表2)。

2.4 塔里木裂腹魚早期仔魚發(fā)育

魚苗出膜進入仔魚期,仔魚出膜4 d后進入平游期。本試驗對1～36 d仔魚發(fā)育進行觀察,將對1～36 d仔魚發(fā)育劃分為以下幾個時期。

2.4.1 卵黃囊期(1～6 d齡) 1 d仔魚體透明,全身無色素,體長為(7.21±0.16)mm(圖5-1 d);2 d仔魚眼球色素出現(xiàn)(圖5-2 d);3 d仔魚消化道貫通(圖5-2 d);4 d仔魚開始平游,眼球色素明顯加深(圖5-4 d);6 d仔魚卵黃囊體積明顯縮小,背部出現(xiàn)黑色素(圖5-6 d)。

2.4.2 彎曲前期(7～17 d齡) 7 d仔魚卵黃囊被吸收完全,鰾充氣膨大,尾鰭條開始出現(xiàn)(圖5-7 d);11 d仔魚身體前部、中部、尾部均可見黑色素分布(圖5-11 d);17 d仔魚腸道前端開始彎曲(圖5-17 d)。

2.4.3 彎曲期(18～26 d齡) 18 d仔魚背鰭褶縮小,脊椎向上彎曲形成鰾前室(圖5-18 d);19 d仔魚出現(xiàn)背鰭條,臀鰭褶縮小形成獨立臀鰭,尾鰭開始分叉(圖5-19 d);26 d仔魚尾鰭叉形明顯(圖5-26 d)。

2.4.4 彎曲后期(27～36 d齡) 27 d仔魚尾鰭叉形逐漸加深(圖5-27 d);31 d仔魚背鰭與臀鰭全部形成(圖5-31 d);34 d仔魚腹鰭條開始出現(xiàn)(圖5-34 d);36 d仔魚腹鰭形成完全,尾下骨與脊索完全垂直,此時仔魚全長為(19.42±0.87)mm(圖5-36 d)。

2.5 塔里木裂腹魚人工繁殖試驗結(jié)果

2020年4月23日至6月3日在察汗烏蘇魚類增殖放流站催產(chǎn)塔里木裂腹魚親魚44組,進行5批次塔里木裂腹魚人工繁殖試驗,如表3所示,共獲取成熟卵粒25.08萬粒,平均催產(chǎn)率為59.09%,平均受精率為68.78%,平均孵化率86.37%,獲水花魚苗14.9萬尾。

表3 塔里木裂腹魚人工繁殖試驗Table3 Artificial propagation test of S.biddulphi

3 討論

3.1 人工催產(chǎn)

對野生珍稀魚類進行人工馴養(yǎng)和繁殖是保護瀕危物種的重要手段,但大多數(shù)野生魚類在人工飼養(yǎng)時,不能順利實現(xiàn)自我繁衍[10]。在人工調(diào)控的環(huán)境條件下,對魚類注射人工合成激素,是實現(xiàn)魚類繁殖和人工助產(chǎn)的有效途徑之一[11-12]。魚類人工催產(chǎn)時的效率受魚的品種、催產(chǎn)藥物種類及劑量和水溫等因素的影響,合適的催產(chǎn)藥物種類及劑量可以有效提高催產(chǎn)率[13-14]。本試驗中塔里木裂腹魚催產(chǎn)藥物種類及劑量與拉薩裂腹魚(Schizothorax waltoni)[LRH-A2(10μg/kg)+DOM(10 mg/kg)][14]、昆明裂腹魚(Schizothorax grahami)[LRH-A2(220μg/kg)+HCG(1 500 IU/kg)+DOM(10 mg/kg)][15]、重口裂腹魚[Schizothorax(Racoma)davidi][RH-A2(10μg/kg)+DOM(2 mg/kg)][16]、四川裂腹魚(Schizothorax kozlovi)[LRH-A2(15μg/kg)+PG(5 mg/kg)+HCG(1 500 IU/kg)][17]、雙須葉須魚(Ptychobarbus dipogon)[RH-A2(6μg/kg)+PG(3 mg/kg)][18]等裂腹魚亞科魚類差別較大,催產(chǎn)水溫在裂腹魚亞科魚類中屬于較高水平。推測由于魚的種類、所用催產(chǎn)藥物及劑量、水溫不同,造成魚類催產(chǎn)效率也各不相同。如何有效提高裂腹魚亞科魚類人工催產(chǎn)效率,有待進一步研究。

在實際生產(chǎn)中,催產(chǎn)素的綜合使用是提高塔里木裂腹魚產(chǎn)卵率的有效方法,根據(jù)親魚的發(fā)育情況,可以選擇1～2次注射。發(fā)育較好的親魚可以進行1次注射,發(fā)育較差的親魚和初產(chǎn)魚則必須進行2次注射[12]。塔里木裂腹魚親本催產(chǎn)前,需投喂高蛋白餌料以保證親魚的強化培育。催產(chǎn)后,親魚有時會因應(yīng)激反應(yīng)過強而死亡,所以在生產(chǎn)過程中,需要將催產(chǎn)后的塔里木裂腹魚盡快放入高溶氧的養(yǎng)殖池中,等其體質(zhì)恢復(fù)后,再放入土池塘中進行飼養(yǎng)。塔里木裂腹魚為國家瀕危保護魚類,野外種質(zhì)資源十分稀少,人工繁殖又需要進行野外引種,這將對野生種群造成極大破壞。因此,有效提高親魚的催產(chǎn)率和產(chǎn)后成活率,對塔里木裂腹魚的保護具有重大意義。

3.2 不同河流中塔里木裂腹魚的胚胎發(fā)育差異

將克孜勒河塔里木裂腹魚與阿克蘇河[6]、車爾臣河[7]塔里木裂腹魚胚胎發(fā)育進行比較(表5):三者卵徑、初孵仔魚長度、卵黃消失時間相近,說明三個地理的塔里木裂腹魚種群繁殖性狀較為相似;克孜勒河和車爾臣河塔里木裂腹魚胚胎發(fā)育歷時相近,而阿克蘇河塔里木裂腹魚胚胎發(fā)育歷時較長,為101.9 h;克孜勒河塔里木裂腹魚出膜時前已經(jīng)形成心臟、胸鰭原基和血液循環(huán),而車爾臣河群體出膜前僅出現(xiàn)肌肉效應(yīng),阿克蘇河群體出膜前只出現(xiàn)心臟搏動,三個地理種群胚盤發(fā)育歷時和出膜時發(fā)育階段不同?？俗卫蘸铀锬玖迅刽~人工孵化水溫較高,始終維持在19～19.2℃,而車爾臣河塔里木裂腹魚孵化最低水溫為16℃,阿克蘇河塔里木裂腹魚孵化最低水溫為14℃,推測可能孵化水溫不同,造成了不同地理群體胚胎發(fā)育時間和出膜時發(fā)育階段的存在差異。

溫度是影響魚類生殖的關(guān)鍵因素之一[19-20]。水溫調(diào)控性腺發(fā)育成熟具有完整的機制:適宜的溫度可以促使魚類的下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(Gn RH),激發(fā)垂體分泌促性腺激素(GTH)作用于性腺,性腺接受信號后分泌性類固醇激素,誘導性腺發(fā)育成熟并排出卵子或精子[21-22]。當水溫過高或者過低時,該機制的啟動會受到極大的影響,導致人工催產(chǎn)效率下降,魚類也會因此出現(xiàn)排卵困難或難產(chǎn)的情況[23]。本研究驗證最優(yōu)催產(chǎn)藥物濃度時,于(16.5±0.5)℃水溫條件下催產(chǎn)率則達到(76.67±0.06)%,推測塔里木裂腹魚在16℃左右的水溫條件下,對外源激素敏感性上升,性腺加快成熟,人工催產(chǎn)效率提高,親魚更容易排出卵子或精子。探索塔里木裂腹魚人工催產(chǎn)所需的最適水溫,是提高人工繁殖效率的關(guān)鍵。

3.3 塔里木裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類的胚胎發(fā)育差異

將塔里木裂腹魚與厚唇裂腹魚(S.irregularis)[8]、齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)[24]、重口裂腹魚[S.(Racoma)davidi][25]、異齒裂腹魚(Schizothorax oconnori)[26]、扁吻魚(Aspiorhynchus laticeps)[27]等其他裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育進行比較:由于裂腹魚亞科是棲息在高海拔和低溫水域環(huán)境中的冷水性魚類,其繁殖生育水溫也相對較低,所以裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育溫度較低,均未超過22℃[8,24-27];塔里木裂腹魚胚胎發(fā)育用時最短,可能魚類品種不同可能造成了胚胎發(fā)育用時存在差異;塔里木裂腹魚的受精卵卵徑在幾種裂腹魚亞科魚類屬于較小類型,較小卵徑在一定程度上縮短了塔里木裂腹魚孵化時間,加快塔里木裂腹魚發(fā)育為仔魚的速度,有利于其更早適應(yīng)外界環(huán)境[28-29]。出膜階段時塔里木裂腹魚、齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)和扁吻魚(Aspiorhynchus laticeps)處于血液循環(huán)器,厚唇裂腹魚處于胸鰭原基期,重口裂腹魚處于心臟搏動期,異齒裂腹魚(Schizothorax oconnori)處于心臟原基期。塔里木裂腹魚在胚胎發(fā)育的過程中心臟、胸鰭原基及血液循環(huán)均在孵化出膜前形成,這有利于其仔魚更好地適應(yīng)外界環(huán)境[30]。塔里木裂腹魚、厚唇裂腹魚和重口裂腹魚都是尾部先出膜,齊口裂腹魚、異齒裂腹魚和扁吻魚出膜方式均為頭部或尾部出膜,筆者推測出膜方式可能與魚類品種有關(guān)。

3.4 塔里木裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類的仔魚發(fā)育差異

塔里木裂腹魚初孵仔魚最短,推測塔里木裂腹魚初孵仔魚在裂腹魚亞科中屬小型。較小體型可以靈活游動,進入巖石等狹縫躲避捕食者獵食[31-32];塔里木裂腹魚仔魚出膜后7 d后卵黃囊消耗殆盡,時間較短。卵黃囊營養(yǎng)吸收較快,有利于魚體迅速生長和新陳代謝,促進仔魚器官分化和運動[33]。塔里木裂腹魚在卵黃囊消失前消化道完全貫通,7 d后,仔魚口、鰓和尾鰭快速發(fā)育,孵化后36 d,塔里木裂腹魚各鰭已基本長成,進入幼魚階段。關(guān)于塔里木裂腹魚卵黃囊確切機制有待于進一步研究。