廣東曬煙大葉密合受青枯病菌侵染后差異表達(dá)蛋白分析

馬柱文，屈玉嬌，潘曉英，陳俊標(biāo)，張振臣，李集勤，黃振瑞，袁清華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省煙草育種與綜合利用工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510640）

【研究意義】煙草青枯病是由雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種土傳細(xì)菌性病害，常暴發(fā)流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］。病菌通常由開(kāi)放性傷口入侵，有些情況下也從主根發(fā)生側(cè)根時(shí)產(chǎn)生的自然開(kāi)口入侵，入侵后病菌進(jìn)入木質(zhì)部，迅速耗盡木質(zhì)部的氧氣并堵塞導(dǎo)管使水分運(yùn)輸受阻［2］，維管組織及木質(zhì)部變色，葉片枯萎，煙株凋亡［3］。該菌宿主范圍極廣，除煙草外，茄子、番茄、馬鈴薯等其他茄科作物均可侵染為害［4-5］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)植物響應(yīng)病原菌的入侵有了更深入的了解［6］。Chen 等［7］對(duì)抗、感兩個(gè)茄子品種接種青枯病菌后的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，大部分差異表達(dá)基因?qū)儆谏镞^(guò)程類別，其中代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程的基因數(shù)目最多。接種青枯病菌后抗、感兩個(gè)品種的差異表達(dá)蛋白中有85 個(gè)屬于免疫應(yīng)答蛋白。Prasath等［8］對(duì)抗、感兩個(gè)生姜品種接種青枯病菌后的轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出抗性品種105 個(gè)基因在接種之后表達(dá)量上調(diào)，其中包含直接參與通過(guò)水楊酸（SA）介導(dǎo)的超敏反應(yīng)、系統(tǒng)性獲得和細(xì)胞凋亡反應(yīng)抵御病原菌的重要基因。利用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，Park 等［9］發(fā)現(xiàn)馬鈴薯青枯病抗性品種CT206-10 中富甘氨酸RNA 結(jié)合蛋白（Glycinerich RNA binding protein，GRP）、番茄脅迫誘導(dǎo)-1蛋白（Tomato stress induced-1 protein，TSI-1）、發(fā)病相關(guān)（Pathogenesis-related，STH-2）蛋白等8 個(gè)響應(yīng)青枯病菌入侵的差異蛋白。利用相同技術(shù)，Afroz 等［10］從青枯病菌接種番茄抗、感兩個(gè)品種中鑒定出9 個(gè)差異表達(dá)蛋白，與感病品種相比，其中的60 ku 伴侶蛋白和Rubisco 活化酶在抗性品種中顯著上調(diào)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大葉密合是廣東封開(kāi)縣主栽曬煙品種，為名優(yōu)晾曬煙品種之一，對(duì)青枯病具有較強(qiáng)且穩(wěn)定的抗性［11-13］。SSR 遺傳圖譜分析顯示大葉密合的6 個(gè)QTL 不同于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗源［14］。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用同位素相對(duì)和絕對(duì)定量標(biāo)記（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）方法研究大葉密合接種青枯病菌后的蛋白質(zhì)表達(dá)量變化，旨在探尋與抗青枯病相關(guān)的功能蛋白及代謝途徑，為煙草抗青枯病分子機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為大葉密合、D101（抗病對(duì)照品種）和長(zhǎng)脖黃（感病對(duì)照品種），均來(lái)源于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理及采集 2019 年7 月15 日播種，人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度27 ℃、濕度80%、光照強(qiáng)度12 000 lx。煙苗生長(zhǎng)至具有6 片真葉成苗期時(shí)，采用傷根灌菌法接種青枯病菌。試驗(yàn)設(shè)置高致病力菌株203（生化型Ⅲ）、低致病力菌株204（生化型亞型Ⅲ-1）［15］以及無(wú)菌水處理3 個(gè)處理，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植12 株，每株淋灌150 mL 細(xì)菌懸浮液，濃度為3.9×108CFU/mL，分別在接菌處理0、3、6、9、

12 h 取新鮮葉片用于RNA 表達(dá)量分析，取樣部位為成苗期最長(zhǎng)葉（第5 片葉）。感病對(duì)照品種長(zhǎng)脖黃莖基部出現(xiàn)發(fā)病癥狀時(shí)，剪取新鮮葉片用于差異蛋白分析，接菌后5、10、15、20 d 調(diào)查發(fā)病率及病情指數(shù)。

1.2.2 差異表達(dá)蛋白分析 將新鮮煙葉樣品用酚抽提法提取蛋白，用裂解液溶解蛋白后再進(jìn)行超聲裂解，蛋白裂解液用DTT 還原處理后進(jìn)行半胱氨酸的烷基化封閉，再加入丙酮-20℃過(guò)夜沉淀蛋白，蛋白沉淀在TEAB 中再次超聲裂解后取上清用于定量。定量的蛋白加入胰蛋白酶消化后真空離心干燥，進(jìn)行iRATQ 標(biāo)記，每組樣品對(duì)應(yīng)一個(gè)分子質(zhì)量（iTRAQ113-大葉密合接種后、iTRAQ114-大葉密合接種前）。標(biāo)記后各組肽段混合，用SCX 進(jìn)行液相分離，MS/MS 鑒定。每個(gè)樣本設(shè)定兩次上機(jī)重復(fù)。蛋白鑒定結(jié)果 經(jīng)MASCOTT2.2 搜索Nicotiana benthamiana、Nicotiana sylvestris、Nicotiana tabacum等3 個(gè) 物種的整合數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)?shù)鞍棕S度比（即差異倍數(shù)）達(dá)到1.5 倍以上且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P值小于0.05 時(shí)，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白，差異蛋白進(jìn)行GO 分析和Pathway 富集分析。

1.2.3 煙草凝集素基因轉(zhuǎn)錄水平分析 采用Trizol法提取新鮮煙草葉片RNA，采用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度，采用瓊脂糖電泳技術(shù)測(cè)定RNA純度和完整度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen 公司）進(jìn)行cDNA 合成，反轉(zhuǎn)錄引物混合使用隨機(jī)引物和Oligo（dT）。使 用Fast SYBR?Green Master Mix Bulk Pack 試劑盒公司熒光定量擴(kuò)增煙草凝集素基因Nictaba，以actin為內(nèi)參。actin引物序列：actinf：5′-AAGGGATGCGAGGATGGA-3′；actinr：5′-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3′，Nictaba引物序列：Nictabaf：5′-AGGGTAGCTTGGCTTGAC-3′；nictabar：5′-TCTTAGCGATGCTGTGGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳確認(rèn)。以2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情指數(shù)分析

由表1 可知，接入高致病力菌株203（生化型Ⅲ）后，感病對(duì)照品種長(zhǎng)脖黃最先出現(xiàn)植株枯萎癥狀，抗病對(duì)照品種D101 于接菌后5 d 出現(xiàn)植株枯萎癥狀，大葉密合于接菌后10 d 出現(xiàn)植株枯萎癥狀。大葉密合的青枯病抗性表現(xiàn)優(yōu)于抗病對(duì)照品種D101。參試品種接入低致病力菌株204（生化型亞型Ⅲ-1），植株發(fā)病程度有所減緩，這與菌株致病力高度相關(guān)。接菌處理20 d 后，參試品種發(fā)病率均達(dá)75%以上，感病對(duì)照品種長(zhǎng)脖黃發(fā)病率接近100%。

表1 參試品種接種青枯病菌后發(fā)病情況Table 1 Incidence of tested varieties after inoculation with Ralstonia solanacearum

2.2 蛋白質(zhì)信息鑒定

由圖1 可知，成功鑒定的有定量信息的蛋白共有1 312 個(gè)，其中共有蛋白1 277 個(gè)。GO 注釋包含描述基因的分子功能（Molecular function）、所處的細(xì)胞位置（Cellular component）、參與的生物過(guò)程（Biological process）。對(duì)總蛋白進(jìn)行GO注釋，鑒定到的蛋白在生物過(guò)程中占比較大條目為代謝過(guò)程（Metabolic process，26.55%）和細(xì)胞過(guò)程（Cellular process，24.09%），在分子功能中催化（Catalytic，41.03%）和結(jié)合（Binding，46.4%）占多數(shù)，而細(xì)胞組分中主要條目為細(xì)胞（Cell，25.51%）和細(xì)胞部分（Cell part，25.51%）。

圖1 GO 注釋分析Fig.1 GO annotation analysis

2.3 COG 功能分析

蛋白相鄰類的聚簇（Cluster of Orthologous Groups of proteins，COG）是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)。構(gòu)成每個(gè)COG 的蛋白均被假定為來(lái)自同一個(gè)祖先蛋白，且為Orthologs 或Paralogs。Orthologs 指來(lái)自于不同物種的由垂直家系（物種形成）進(jìn)化而來(lái)的蛋白，且特異地保留與原始蛋白相同的功能。Paralogs 指在一定物種中的來(lái)源于基因復(fù)制的蛋白，可能會(huì)進(jìn)化出新的與原來(lái)有關(guān)的功能。對(duì)鑒定蛋白進(jìn)行分類，翻譯后的修飾、蛋白周轉(zhuǎn)、分子伴侶（Posttranslational modification,protein turnover,chaperones）蛋白數(shù)量最多，其次是整體功能類（General function prediction only），RNA 加工與修飾類（RNA processing and modification）數(shù)量最少，具體如圖2 所示。

圖2 表達(dá)蛋白COG 功能分類Fig.2 Classification of COG function of expressed proteins

2.4 接種青枯病菌后差異表達(dá)蛋白分析

通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，對(duì)比接種青枯病菌前后的煙草葉片蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)35 個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中21 個(gè)下調(diào)表達(dá)、14 個(gè)上調(diào)表達(dá)，共有25 個(gè)蛋白參與到植物應(yīng)對(duì)外界刺激反應(yīng)過(guò)程中（表2）。上調(diào)程度最大的蛋白為Hav1，屬于煙草凝集素家族?，F(xiàn)已在普通煙草不同品種中發(fā)現(xiàn)Hav1 的同源基因有sam1、sam2、sam3、sam4、hav1、hav2、wis、xan和by-2。這些凝集素基因高度保守，由165 個(gè)氨基酸編碼的蛋白在7 類氨基酸的位置上有差異。

表2 利用iTRAQ 技術(shù)在煙草葉片中鑒定到的差異表達(dá)蛋白Table 2 Differentially expressed proteins in tobacco leaves identified by iTRAQ

2.5 接種青枯病菌后煙草凝集素表達(dá)量變化

以煙草actin為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)煙草凝集素基因在抗病和感病兩個(gè)煙草品種分別接種致病和低致病青枯病菌后的相對(duì)表達(dá)量。由于煙草凝集素家族基因的高度保守性，擴(kuò)增片段包括該家族中的所有基因。接種致病與非致病青枯病菌后煙草凝集素在兩個(gè)煙草品種中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖3），其中大葉密合煙草凝集素表達(dá)量的上升程度較長(zhǎng)脖黃更高。長(zhǎng)脖黃煙草凝集素的表達(dá)量在接種非致病菌后6 h 達(dá)到最高值，其余處理煙草凝集素表達(dá)量均在接菌后9 h 達(dá)到最高，接菌后12 h 的表達(dá)量較接菌后6 h 和9 h 下降。

圖3 參試品種接種青枯病菌后煙草凝集素的表達(dá)量Fig.3 Expression of nictaba in tested varietiesafter inoculation with Ralstonia solanacearum

3 討論

植物免疫激活的兩個(gè)平行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一位于葉綠體。葉綠體介導(dǎo)的免疫信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致葉綠體源的活性氧（ROS）及抵御相關(guān)激素（如水楊酸SA、茉莉酸JA）的產(chǎn)生［16］。植物受到脅迫的反應(yīng)之一是生成ROS，但是大量ROS會(huì)損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此ROS 的生成和代謝需要依靠氧化還原反應(yīng)維持在穩(wěn)定狀態(tài)。本研究在抗性品種大葉密合中鑒定到在氧化還原平衡調(diào)控中起重要作用的5 個(gè)蛋白，包括多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、α 雙加氧酶和2 個(gè)硫氧還原蛋白。位于葉綠體中的6 個(gè)蛋白在接菌前后發(fā)生差異表達(dá)：2個(gè)硫氧還原蛋白、類囊體腔15 ku 蛋白及丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）表達(dá)量降低，5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶和光合系統(tǒng)Ⅰ亞基Ⅶ蛋白表達(dá)量升高。由于光合系統(tǒng)的蛋白通常協(xié)同表達(dá)，呈現(xiàn)相似的表達(dá)趨勢(shì)。Cheng 等［17］發(fā)現(xiàn)野火病菌（Pseudomonas syringaepv.tabaci）感染后煙草光合系統(tǒng)Ⅰ的活性下降，同時(shí)PsbO 蛋白、D1 蛋白和PsaA 蛋白發(fā)生降解。沈喜等［18］調(diào)查抗病品種小麥感染條銹病菌后葉綠素含量在0～12 d 內(nèi)的變化，發(fā)現(xiàn)葉綠素在0～3 d 下降，之后呈上升趨勢(shì)。葉綠體中的PPDK 在接菌后表達(dá)量下降，該酶也在光合作用中發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)該酶活性在煙草受到馬鈴薯病毒Y 侵染或干旱脅迫時(shí)提高。酶活性受翻譯后加工的影響，并不一定與酶的豐度直接相關(guān)［19］。由于植物受病菌感染后，參與免疫反應(yīng)的蛋白和RNA 的表達(dá)量也處于動(dòng)態(tài)變化中，取樣時(shí)機(jī)對(duì)差異蛋白的鑒定及表達(dá)豐度有較大影響。茉莉酸及其衍生物在植物多個(gè)生物過(guò)程尤其是生物脅迫（如病原菌入侵、咀嚼式口器昆蟲(chóng)取食）中發(fā)揮作用［20-21］。本研究鑒定到的差異蛋白中上調(diào)幅度最大的是凝集素家族成員之一的Hav1。凝集素廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，具有至少1 個(gè)可以可逆結(jié)合特定單糖或寡糖的非催化結(jié)構(gòu)域［22］。凝集素蛋白由于具有細(xì)胞與蛋白或細(xì)胞與細(xì)胞之間的識(shí)別特性而參與到多種生物過(guò)程中，尤其是在免疫防御中發(fā)揮作用［23-24］。本研究調(diào)查了煙草凝集素在參試品種接菌后0～12 h 的轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)煙草凝集素在接菌處理后9 h達(dá)到最高值后開(kāi)始下降。斜紋夜蛾幼蟲(chóng)對(duì)煙草的取食實(shí)驗(yàn)表明，煙草凝集素的RNA 在取食10 h后表達(dá)量最高，之后略有下降，而蛋白表達(dá)量從開(kāi)始取食后逐步升高，到取食后15 h 達(dá)到峰值，之后維持該水平到36 h 調(diào)查結(jié)束［25-26］，該研究中煙草凝集素的RNA 隨時(shí)間變化趨勢(shì)與本研究結(jié)果類似。

4 結(jié)論

廣東晾曬煙品種大葉密合具有良好的青枯病抗性。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，青枯病菌接種后大葉密合21 個(gè)蛋白表達(dá)量下調(diào)，14 個(gè)蛋白表達(dá)量上調(diào)。其中煙草凝集素蛋白Hav1上調(diào)表達(dá)量最大，煙草凝集素的轉(zhuǎn)錄在接菌后6 h和9 h達(dá)到最高值。鑒定到的差異蛋白中，上調(diào)幅度最大的是凝集素家族成員之一的Hav1，接種強(qiáng)致病力和無(wú)致病力菌株后煙草凝集素呈現(xiàn)類似的表達(dá)模式，表明凝集素蛋白可能在對(duì)病菌入侵后的上游反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用。