張雅莉，韓建勛,，宋 薇，魏海燕，侯衛(wèi)靜，富 玉，付 萌，李 婷

(1.譜尼測試集團股份有限公司，北京 100095；2.譜尼測試集團北京檢驗認證科學研究院有限公司，北京 100095)

可可是一種重要的經濟作物，其種子可可豆可制作成可可粉等可可制品?？煽煞酆胸S富的多酚、可可堿、可可脂、粗纖維、蛋白質等營養(yǎng)和活性成分，是世界上三大嗜好性飲料之一[1-3]。目前，全球對可可的需求正在日益增加[4]，約有60個國家種植可可樹，然而只有厄瓜多爾等少數(shù)國家是可可的主要出口國[4-5]，導致可可價格一直居高不下[6]，給可可及可可制品的質量把控提出了更高要求?？煽煞壑袚饺肟煽蓺な浅Ｒ姷馁|量問題[2,7]，其存在不僅會影響感官體驗，還可能引起霉菌毒素、重金屬或微生物等污染[8]?？煽煞壑锌煽蓺さ膿饺胫饕?種途徑：1) 人為添加，為牟取暴利一些不法企業(yè)以飼料名義進口可可殼，粉碎加工后噴上可可香精摻入可可粉中[9]；2) 生產過程殘存，在一定程度上，可可加工過程中可可殼的殘存是不能完全避免的[8,10]。可可粉中可可殼的摻入量是其質量控制的重要參數(shù)[9]，目前國內外尚無可可粉中可可殼摻入量的質控標準，國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission, CAC)發(fā)布的CXS 141-1983標準規(guī)定，可可漿和可可蛋糕中可可殼摻入量的限值為5%，已成為可可加工行業(yè)普遍接受的可可殼摻入限值[8]。

目前，可可粉中可可殼摻入量的檢測方法有顯微鏡法[11]、重量法[12]、分光光度法[13]、液相色譜法[9,14-15]以及近紅外光譜法[16]等，均取得了較好的研究進展。顯微鏡法操作簡單，但難以定量[9]；重量法通過測定可可粉溶液中沉降成分的質量來評估可可殼的摻入量，難以得到穩(wěn)定準確的檢測結果[17]；分光光度法和液相色譜法主要通過測定可可粉或可可殼中多糖、脂質、脂肪酸色酰胺等特征成分含量來評估可可殼含量，但是方法的靈敏度較低[9]。胡明華等[2]利用酸水解及柱前衍生的HPLC指紋圖譜法分析可可粉的多糖組分，結合系統(tǒng)聚類分析法可對摻入15%及以上可可殼的可可粉予以鑒別；張九魁等[9]建立了固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法檢測可可粉中二十二烷酸色酰胺和二十四烷酸色酰胺的含量，鑒別出摻入5%及以上可可殼的摻假可可粉。近紅外光譜技術具有快速、無損等優(yōu)點，其結合化學計量學方法建立模型后，可實現(xiàn)可可粉中可可殼的定性定量檢測，但該方法對于定標樣本數(shù)據(jù)和模型的精確性都有很高的要求，需采集廣泛的代表性樣本，才能保證結果的穩(wěn)定性和準確性[8,18-19]。超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-tandem mass spectrometry, UPLC-Q-TOF MS/MS)將具有高分離度、高靈敏度的液相色譜系統(tǒng)與能同時提供母離子和碎片離子準確質量數(shù)以及元素組成的高分辨質譜有機結合，對復雜基質中未知化合物的鑒定具有優(yōu)勢，被廣泛應用于食品、藥品等領域的摻假鑒別研究[20-21]。

本研究擬采用UPLC-Q-TOF MS/MS技術結合UNIFI軟件以及化學計量學算法，通過確定可可殼相對于可可粉的特征標志物，建立可可粉中摻雜可可殼的定量檢測方法，旨為可可粉的質量評價與控制提供科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Waters Xevo G2-XS QTOF/UPLC系統(tǒng)：美國Waters公司產品，配有MassLynx軟件(V4.1)和UNIFI軟件(V1.9.4)；ST-04A多功能粉碎機：上海樹立儀器儀表有限公司產品；H1850臺式高速離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司產品；N-1100旋轉蒸發(fā)儀：日本東京理化器械株式會社產品；AB135-S分析天平(感量0.01 mg)、AB204-S分析天平(感量0.1 mg)：瑞士Mettler Toledo公司產品；0.22 μm有機相濾膜(尼龍)：天津博納艾杰爾科技有限公司產品。

1.2 材料與試劑

可可豆(4個批次，產地為厄瓜多爾)，可可粉(來源4個不同生產廠家)，以上樣品均于室溫避光儲藏。

甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher Scientific公司產品；乙酸銨：優(yōu)級純，天津津科精細化工研究所產品；亮氨酸腦啡肽：分析純，美國Waters公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品制備 自制可可粉和可可殼粉：將可可豆果實(可食部分)和可可豆果皮分開，磨粉過125目篩，分別標記為可可粉組(G組)和可可殼粉組(K組)，置于陰涼干燥處，待測。

模擬制備可可粉中摻雜可可殼粉：分別稱取0、0.1、0.5、1、2、5 g(精確0.001 g)可可殼粉于50 mL干燥具塞離心管中，再加入一定量的可可粉至共10 g，充分混合，制備得到可可殼摻入量分別為0、1%、5%、10%、20%、50%的可可粉摻雜模擬樣品，置于陰涼干燥處，待測。

盲樣制備：分別將4個批次的可可粉和可可殼粉進行等比例混合，得到混合的可可粉和可可殼粉；再將以上不同批次混合后的可可粉和可可殼粉按一定比例混合，模擬制成3個盲樣，置于陰涼干燥處，待測。

1.3.2樣品前處理 準確稱取約1 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL具塞離心管，加約20 mL甲醇，渦旋混勻，超聲20 min；取出后以8 000 r/min離心5 min，收集上清液，向殘渣中加入20 mL甲醇重復提取，合并上清液；將上清液于40 ℃旋蒸至干，加入1 mL甲醇復溶，過0.22 μm濾膜，待分析。其中，為監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性和重復性，在進行可可粉和可可殼粉樣品前處理后，吸取同等體積的樣品溶液混勻，作為質控(QC)樣品。每個樣品平行測定3次。

1.3.3儀器條件 液相色譜條件： Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；柱溫40 ℃；流動相：MSE和MS/MS模式下流動相A分別為水和乙酸銨水溶液(5 mmol/L)，流動相B均為乙腈，洗脫梯度列于表1；流速0.3 mL/min；進樣體積5 μL。

表1 流動相洗脫梯度Table 1 Elution gradient of mobile phase

MSE模式質譜條件：ESI離子源，正、負離子模式；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度250 ℃；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣流速50 L/h；毛細管電壓2.0 kV；錐孔電壓40 V；靈敏度模式掃描；質量掃描范圍m/z50～1 200；掃描時間0.2 s；碰撞能量：低碰撞能量為off，高碰撞能量為10～35 eV；實時校正液：亮氨酸腦啡肽，正離子條件m/z556.277 1，負離子條件m/z554.261 5。

UNIFI軟件參數(shù)設置：高能量和低能量下響應閾值分別為50、250；精確質量偏差閾值5 mu；可識別的化合物加合峰形式包括+H、+H2O+H、-H、+e峰；實時校正液：亮氨酸腦啡肽，正離子條件m/z556.276 6，負離子條件m/z554.262 0。

MS/MS模式質譜條件：ESI離子源，負離子模式；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度250 ℃；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣流速50 L/h；毛細管電壓2.0 kV；錐孔電壓40 V；靈敏度模式掃描；質量掃描范圍m/z50～500；監(jiān)測母離子m/z375.18，監(jiān)測子離子m/z191.07*、289.07(*為定量離子)；掃描時間0.2 s；碰撞能量15～40 eV；實時校正液：亮氨酸腦啡肽，m/z554.261 5。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將采集的可可粉(G組)和可可殼粉(K組)MSE數(shù)據(jù)導入UNIFI軟件中完成質量校正、加合離子設定等處理，進行化合物峰提取，并結合UNIFI軟件自帶的天然活性物質數(shù)據(jù)庫進行自動匹配鑒定；將經UNIFI軟件處理的數(shù)據(jù)導入EZinfo軟件進行無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis, PCA)與有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別式分析(orthogonal partial least squares-discriminate analysis, OPLS-DA)。

1.5 特征標志物的篩選與鑒定

根據(jù)OPLS-DA模型的變量投影重要性(variable importance in the project, VIP)篩選潛在特征標志物，設置VIP≥3，且以僅存在于可可殼中為原則確定可可殼的特征標志物，并進行鑒定。

1.6 定量檢測模型的構建

為定量檢測可可粉樣品中可可殼粉的摻入情況，在可可粉中加入可可殼粉，制成質量分數(shù)分別為0%、1%、5%、10%、20%和50%的可可粉摻雜模擬樣品，按照1.3.3節(jié)MS/MS模式的液相色譜和質譜方法上機采集數(shù)據(jù)，以可可粉中可可殼粉的摻入量為橫坐標，特征標志物苦木內酯Ⅰ的峰面積為縱坐標，擬合線性標準曲線，采用保留時間定性，外標法定量。

2 結果與分析

2.1 可可粉與可可殼粉代謝指紋圖譜分析

采用UPLC-Q-TOF MS/MS技術在正、負離子模式下采集可可粉和可可殼粉樣品的信息，生成基峰色譜圖(base peak intensity, BPI)，示于圖1?？梢?，可可粉和可可殼粉中的相關組分在28 min內均得到較好的分離和響應值，且譜峰差異明顯。通過統(tǒng)計圖1的譜峰，在正離子模式下，可可粉和可可殼粉分別有31、32個響應較高的譜峰；而在負離子模式下，可可粉和可可殼粉分別有58、61個響應較高的譜峰；負離子模式下的離子響應明顯優(yōu)于正離子模式。因此，本研究采用負離子模式對相關數(shù)據(jù)進行分析。

注：a，b.正離子模式;c，d.負離子模式

使用UNIFI軟件處理負離子模式下采集的MSE原始數(shù)據(jù)，進行峰識別和對齊后，得到包含母離子質荷比、保留時間和離子響應強度的數(shù)據(jù)矩陣，結合UNIFI軟件自帶的天然活性物質數(shù)據(jù)庫對可可粉和可可殼粉中響應較高的譜峰進行歸屬，其相關信息分別列于表2和表3。

表2 負離子模式下，可可粉中鑒定的成分Table 2 Components of cocoa powder identified in negative ion mode

表3 負離子模式下，可可殼粉中鑒定的成分Table 3 Components of cocoa shell powder identified in negative ion mode

2.2 定性判別分析

PCA分析屬于一種模糊識別方式，是將復雜數(shù)據(jù)進行降維處理，剔除冗余數(shù)據(jù)后，找出對整體貢獻值最大的信息[22]，通過原始數(shù)據(jù)直觀地反映2組樣品間的整體差異，但是無法消除隨機誤差和組內誤差[23]。將2.1節(jié)UNIFI軟件分析得到的包含母離子質荷比、保留時間和離子響應強度的數(shù)據(jù)矩陣導入EZinfo軟件進行PCA分析。結果表明，所有QC樣品在PCA得分圖上緊密聚集在一起，而且同1個樣品的3個平行實驗也緊密聚集在一起，表明數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，示于圖2。G組和K組樣品在PCA模型的第二主成分上聚集成2類，示于圖2a，表明可可粉和可可殼粉的化學成分存在明顯差異。同時，2組樣品點分布都有所離散，表明不同批次間的可可粉和可可殼也存在一定的組分差異。

圖2 可可粉與可可殼粉的PCA(a)和OPLS-DA(b)得分圖Fig.2 PCA (a) and OPLS-DA (b) scores plot of cocoa powder and cocoa shell powder

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，可降低樣品組內差異、放大組間差異，排除無關因素對實驗數(shù)據(jù)造成的影響，從而實現(xiàn)對不同樣品的有效預測[24]。為充分提取2組樣品檢測的差異信息，準確篩選出可可殼粉的特征標志物，進一步采用OPLS-DA模型分析數(shù)據(jù)。結果表明，可可粉和可可殼粉樣品在OPLS-DA得分圖上聚集成2類，得以明顯區(qū)分，示于圖2b。

2.3 定量檢測分析

2.3.1特征標志物的應用 通過建立OPLS-DA模型，得到可可粉與可可殼粉的S-plot圖，示于圖3。在S-plot圖中分布的點越靠近兩極，代表對應化合物對2組樣品分組的貢獻程度越大，VIP值也越大。以VIP≥3且S-plot圖中的模型參數(shù)p[1]>0為篩選條件，初步得到119個化合物信息，這些化合物在可可殼粉中的含量均大于可可粉中的含量。選擇在K組中檢測到而在G組中未檢測到的化合物作為特征標志物，共得到23個化合物信息，如tR=1.83 min(m/z267.048 9)、tR=2.10 min(m/z315.072 5)、tR=3.48 min(m/z467.121 1)、tR=6.04 min(m/z187.095 0)、tR=6.66 min(m/z177.016 7)、tR=12.34 min(m/z375.183 1)、tR=18.88 min(m/z331.244 9)、tR=19.38 min(m/z313.235 6)等，對其進一步推測鑒定。其中，tR=12.34 min(m/z375.183 1)經與天然活性物質數(shù)據(jù)庫匹配，鑒定為苦木內酯Ⅰ(nigakilactone Ⅰ)，示于圖3?？嗄緝弱ア竦馁|譜信息及其母離子(m/z375.183 1)、碎片離子(m/z315.086 0、289.070 2、191.073 0)的歸屬示于圖4。因此，可將苦木內酯Ⅰ作為可可殼粉的特征標志物用來鑒定可可粉中可可殼粉的摻入。

注：紅框表示VIP≥3的化合物

圖4 苦木內酯Ⅰ的質譜圖Fig.4 Mass spectrum of nigakilactone Ⅰ

2.3.2定量檢測模型信息 按1.6節(jié)方法得到的線性標準曲線示于圖5。結果可知，在可可殼粉摻入量為1%～50%范圍內，苦木內酯Ⅰ峰面積與可可殼粉摻入量之間的線性關系良好，線性方程為y=187.82x+646.96，相關系數(shù)(R2)大于0.999 9，檢出限(LOD,S/N≥3)為0.3%，定量限(LOQ,S/N≥10)為1%。

圖5 苦木內酯Ⅰ峰面積和可可殼粉摻入量之間的標準曲線Fig.5 Standard curve between the peak area of nigakilactone Ⅰ and the content of cocoa shell powder

2.3.3盲樣驗證以及市售樣品檢測 為驗證方法的可靠性與適用性，對模擬制備的3份盲樣和4份市售可可粉樣品進行定量檢測，結果列于表4。其中，7份樣品檢測含量的相對標準偏差(RSD)在0.89%～2.28%范圍內，表明本方法精密度良好；3份盲樣檢測出的可可殼粉含量與實際摻入量基本一致，相對誤差在3.89%～7.81%范圍內，表明本方法準確度較好；4份市售可可粉樣品中可可殼粉的檢測含量分別為9.03%、2.51%、3.33%、2.79%。參考CXS 141-1983規(guī)定，推測市售可可粉樣品1中可能人為摻入了可可殼，其他3份市售樣品中檢測到的可可殼可能來自加工過程中的污染。由此，所建立的方法可用于市售可可粉中摻入可可殼的定量檢測。

表4 盲樣和市售可可粉樣品中可可殼粉摻入量的檢測結果Table 4 Results of the contents of cocoa shell power in blind samples and commercial samples

3 結論

為實現(xiàn)可可粉中可可殼的定性定量檢測，本研究采用UPLC-QTOF MS/MS技術，以厄瓜多爾產地可可豆為研究對象，通過分析可可粉與可可殼粉中的組分差異，結合PCA和OPLS-DA模型，在無監(jiān)督和有監(jiān)督2種模式下，實現(xiàn)了對純可可粉和可可殼粉的判別區(qū)分。在此基礎上，發(fā)現(xiàn)苦木內酯Ⅰ是可可殼粉的特征標志物?？嗄緝弱ア駥儆诳嗄緝弱ヮ惢衔?，苦木內酯類化合物結構相似，為苦木科鴉膽子屬植物中主體特征生物活性成分，具有殺蟲止痢、抗瘧、抗腫瘤、抗炎以及降血糖等多種功效[25]。

使用MS/MS模式檢測摻有一定量可可殼粉的可可粉模擬樣品，當沿用MSE模式中使用的液相色譜方法時，發(fā)現(xiàn)目標峰與其他雜峰未完全分離，且峰形有一定的拖尾現(xiàn)象。通過優(yōu)化MS/MS模式下的流動相及其洗脫梯度，目標峰與其他雜峰的分離度較好，且峰形對稱度良好，可用來定量檢測可可粉中可可殼粉的摻入量。本方法的檢出限為0.3%，定量限為1%，與HPLC等方法鑒別摻入可可殼的可可粉研究結果[2,9]對比，本方法的定量限更低，結果更準確。

本方法前處理簡單、準確度高、重復性好、靈敏度高，可為市售可可粉樣品的摻假鑒別提供技術手段。后續(xù)將會選擇更多產地(如西非和亞洲等)的可可豆作為樣品，以進一步補充和完善研究內容。