劉 蓓， 丁 燕,2， 莊林武， 田 偉， 蕭 偉， 朱靖博,2*

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所, 遼寧 大連 116034；3.云南漢素生物科技有限公司，云南 昆明 650114；4.江蘇康緣股份藥業(yè)有限公司, 江蘇 連云港 222000)

工業(yè)大麻為四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻。四氫大麻酚、大麻二酚、大麻酚是大麻中3種主要的大麻素類化合物[1]，其中四氫大麻酚為大麻中的致幻成癮性成分，現(xiàn)代研究證明具有抗腫瘤[2]、保護(hù)心血管[3]、抗菌[4]等藥用價(jià)值；大麻二酚為工業(yè)大麻中最具代表性的非精神活性物質(zhì)，具有抗腫瘤[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、神經(jīng)保護(hù)[7]等活性，在英國已經(jīng)成功開發(fā)為藥品Epidiolex；大麻二酚和四氫大麻酚還有協(xié)同作用[8-9]，四氫大麻酚經(jīng)受熱或氧化為大麻酚[10]，但大麻酚與大麻素受體的親和性不及四氫大麻酚[11]。預(yù)計(jì)2016年至2020年全球工業(yè)大麻市場將翻倍，而中國是最大的工業(yè)大麻生產(chǎn)國之一[12]，所以充分利用工業(yè)大麻中大麻二酚等大麻素的資源是一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。

從工業(yè)大麻中得到大麻二酚和四氫大麻酚的關(guān)鍵步驟是熱處理，此過程中大麻二酚酸脫羧形成大麻二酚，同時(shí)四氫大麻酚酸也形成四氫大麻酚，過程見圖1。Wang[13]等在110 ℃處理大麻提取物時(shí)，大麻二酚酸與大麻二酚，四氫大麻酚酸、四氫大麻酚分別有18.05%、7.94%的損失，其他研究也得到了類似的結(jié)果[14]，此外四氫大麻酚容易轉(zhuǎn)化為大麻酚[10]?，F(xiàn)階段工業(yè)大麻加工過程中熱處理的溫度和時(shí)間各不相同，如何有效得保護(hù)大麻二酚并降低四氫大麻酚含量是一個(gè)值得研究的問題。基于此，本研究采用HPLC-DAD技術(shù)研究了云麻7號(hào)工業(yè)大麻的花在不同條件下熱處理后大麻二酚、四氫大麻酚和大麻酚含量的變化，探討熱處理溫度、時(shí)間以及空氣對三種主要的大麻酚類化合物含量的影響，為工業(yè)大麻的中大麻二酚等大麻素類物質(zhì)的開發(fā)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

圖1 工業(yè)大麻熱處理過程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)

1 材料

1.1 儀器與試劑 大麻二酚、Δ9-四氫大麻酚、大麻酚由云南漢素生物科技有限公司提供，-20 ℃避光保存。Bomexc C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)購自大連博邁科技發(fā)展有限公司。S6000高效液相色譜系統(tǒng)(華譜科儀科技有限公司)；BS224S型電子天平(美國戴安公司)。乙腈為色譜純，購自天津康科德科技有限公司；乙醇、乙酸為分析純，購自天津大茂化學(xué)試劑廠;去離子水由MDF水凈化系統(tǒng)(大連美德環(huán)保設(shè)備有限公司)制備。

1.2 藥材 工業(yè)大麻為云麻7號(hào)花序，由云南漢素生物科技有限公司提供，花序被磨成粉末并過50目篩，在4 ℃下避光保藏。

2 方法

2.1 熱處理?xiàng)l件分析

2.1.1 溫度 工業(yè)大麻在不同溫度下熱處理的實(shí)驗(yàn)裝置見圖2A，將0.600 g樣品置于兩頭均有篩板的不銹鋼物料柱(4.6 mm×100 mm)內(nèi)，打開控制閥1通入0.1 L/min的氮?dú)? min排除氧氣，然后關(guān)閉控制閥1。將物料柱在25、100、120、140、160、180、200、220、240、260 ℃下油浴熱處理30 min，待冷卻到室溫后將物料柱連接到泵(圖2B)，50 mL乙醇通過滲漉法提取工業(yè)大麻中大麻素，體積流量為1.5 mL/min，最后將提取液定容到50 mL，將提取液過濾并進(jìn)行HPLC分析。

圖2 工業(yè)大麻熱處理、大麻素提取裝置

2.1.2 時(shí)間 實(shí)驗(yàn)裝置見圖2A，將0.600 g工業(yè)大麻粉排除氧氣后，在180 ℃下分別熱處理0、10、20、30、60、90、120 min，按“2.1.1”項(xiàng)下方法提取大麻素，并進(jìn)行HPLC分析。

2.1.3 空氣 實(shí)驗(yàn)裝置見圖2A，打開控制閥2接通空氣，使其以0.1 L/min的體積流量持續(xù)流過工業(yè)大麻粉末，在25、100、120、140、160 ℃下熱處理60 min后，按“2.1.1”項(xiàng)下方法提取大麻素，并進(jìn)行HPLC分析。再以氮?dú)鉃閷φ胀ú僮鳌?/p>

2.2 HPLC-DAD測定大麻二酚、四氫大麻酚、大麻酚含量

2.2.1 色譜條件 參照文獻(xiàn)[15]方法并修改。C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.1%乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～50 min，55%～75%B；50～60 min，75%～85%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 甲醇溶解大麻二酚、四氫大麻酚、大麻酚對照品，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定3次。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表 1 大麻二酚、四氫大麻酚、大麻酚線性關(guān)系

3 結(jié)果

3.1 溫度對大麻二酚、四氫大麻酚含量的影響 圖3A～3B顯示，工業(yè)大麻中大麻二酚、四氫大麻酚含量在100～260 ℃時(shí)隨著溫度的升高先升后降，兩者分別在160～180 ℃、160～200 ℃時(shí)最高，分別為(71.36±3.18)、(2.49±0.07)mg/g；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，兩者含量開始緩慢降低，以大麻二酚更明顯；在260 ℃下，兩者含量分別僅為最大值的42.17%、55.61%。

3.2 時(shí)間 圖3C～3D顯示，在180 ℃下熱處理時(shí)，大麻二酚、四氫大麻酚含量在0～150 min內(nèi)隨著時(shí)間延長而升高，分別在30、20～30 min時(shí)達(dá)到最大值，分別為(71.36±3.18)、(2.58±0.09)mg/g；但在150 min后兩者含量有所降低，分別為最大值的92.82%、86.58%。

3.3 空氣 圖3E～3F顯示，相比于氮?dú)猓诳諝庵袩崽幚頃r(shí)大麻二酚、四氫大麻酚含量顯著降低，而且溫度越高越顯著，其中在180 ℃下熱處理60 min后，兩者含量分別僅為(1.34±0.76)、(0.02 ± 0.02)mg/g，分別是在同一溫度、時(shí)間下氮?dú)庵袩崽幚淼?.22%、1.24%，即在高溫下對空氣不穩(wěn)定。工業(yè)大麻中幾乎不含大麻酚，在無氧180 ℃下熱處理60 min時(shí)，大麻酚含量低于檢測線；在空氣中180 ℃下熱處理60 min時(shí)，四氫大麻酚轉(zhuǎn)化為降解產(chǎn)物大麻酚，后者含量顯著升高，為0.05 mg/g，見圖4。因此，在工業(yè)大麻熱處理過程中合適的空氣通入是降低四氫大麻酚含量的有效方法，但同時(shí)也要注意大麻二酚也會(huì)有被破壞的風(fēng)險(xiǎn)。

注：A為在不同溫度下熱處理30 min(大麻二酚)，B為在不同溫度下熱處理30 min(四氫大麻酚)，C為在180 ℃下熱處理不同時(shí)間(大麻二酚)，D為在180 ℃下熱處理不同時(shí)間(四氫大麻酚)，E為在空氣、氮?dú)庵袩崽幚?0 min(大麻二酚)，F(xiàn)為在空氣、氮?dú)庵袩崽幚?0 min(四氫大麻酚)。不同小寫字母之間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖3 不同熱處理?xiàng)l件下大麻二酚、四氫大麻酚含量變化

注：A為對照品，B為工業(yè)大麻提取物，C為工業(yè)大麻在無氧180 ℃下熱處理60 min，D為工業(yè)大麻在空氣中180 ℃下熱處理60 min。1. 大麻二酚 2. 大麻酚 3. 四氫大麻酚圖4 不同熱處理?xiàng)l件下工業(yè)大麻色譜圖

4 討論

熱處理是利用工業(yè)大麻中大麻素資源的必要加工步驟。關(guān)于這一過程的研究多集中在熱處理過程中的大麻二酚酸[14]和四氫大麻酚酸[16]脫去羧基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，本研究則分別探討了溫度、時(shí)間和空氣對熱處理過程中大麻二酚和四氫大麻酚含量的影響方式及程度。為了更全面得了解含量變化的規(guī)律，實(shí)驗(yàn)中熱處理溫度和時(shí)間均有所增加，也增加了工業(yè)大麻接觸空氣的總量。

工業(yè)大麻在受熱時(shí)，隨著溫度的升高脫羧基的反應(yīng)速率加快，在30 min內(nèi)生成的大麻二酚和四氫大麻酚量逐漸增多。但這兩者在高溫下的穩(wěn)定性較差，溫度越高越有利于降解[17-18]。在本研究中，溫度高于200 ℃后大麻二酚和四氫大麻酚的含量開始顯著下降，因此在工業(yè)大麻的熱處理過程中，可以適當(dāng)提高溫度來加快脫羧基的速率，但溫度不宜超過200 ℃。本研究在180 ℃無氧條件下熱處理工業(yè)大麻時(shí)，大麻二酚和四氫大麻酚的含量在20～30 min達(dá)到最大值后開始下降?？梢姛崽幚砉I(yè)大麻的溫度和時(shí)間不同，大麻二酚和四氫大麻酚的含量則不同。

相比于氮?dú)?，充足的空氣使得工業(yè)大麻熱處理過程中大麻二酚和四氫大麻酚的含量急劇減少，可見高溫下這兩者對空氣中的氧氣穩(wěn)定性非常差，并且四氫大麻酚的降解產(chǎn)物大麻酚的含量從低于檢測線提高到0.05 mg/g，含量顯著增加。因此在工業(yè)大麻的熱處理過程中，保持適量空氣的接觸來降低工業(yè)大麻中的四氫大麻酚是重要的。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了工業(yè)大麻的熱處理過程中溫度、時(shí)間和空氣等因素對大麻二酚和四氫大麻酚含量的影響。工業(yè)大麻熱處理過程中，大麻二酚和四氫大麻酚的含量隨著溫度和時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢；相比于氮?dú)?，空氣?huì)使高溫條件下大麻二酚和四氫大麻酚含量的降低的速度加快，且使大麻酚的含量顯著增加。研究結(jié)果表明，工業(yè)大麻植物原料在無氧條件下，熱處理溫度160～180 ℃、時(shí)間20～30 min時(shí)大麻二酚和四氫大麻酚的含量達(dá)到最大值。適量的空氣能降低四氫大麻酚的含量，但也會(huì)損失一定量的大麻二酚。