侯 君 成 玥 李佳識 魏 萊 吳強鵬 劉朝仁 侯 芳

(1 四川省攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科，攀枝花市 617000，電子郵箱：m50veb@163.com；2 重慶佑佑寶貝婦兒醫(yī)院手麻科，重慶市渝北區(qū) 401122)

周圍神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，包括運動神經(jīng)、感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)病變[1]。高糖狀態(tài)可導致組織細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，是引起周圍神經(jīng)病變等糖尿病慢性并發(fā)癥的一個共同機制[2]。糖尿病狀態(tài)下的背根神經(jīng)節(jié)十分脆弱，是高血糖損傷的直接靶點，該神經(jīng)損傷是糖尿病周圍神經(jīng)病變的重要組成部分[3]。因此，尋找有效的背根神經(jīng)節(jié)保護途徑尤為重要。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，黃芪黃酮是黃芪的有效成分之一，有研究顯示，黃芪黃酮可降低糖尿病大鼠模型的血糖、脂聯(lián)素及胰島素水平[4]，但是黃芪黃酮對糖尿病周圍神經(jīng)病變—背根神經(jīng)節(jié)損傷的影響及機制尚未明確。鏈脲佐菌素具有細胞毒性，常用于糖尿病動物模型的建立[5]。因此本研究利用鏈脲佐菌素建立糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠模型，觀察黃芪黃酮對大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)氧化應(yīng)激及細胞凋亡的影響，并研究其作用機制，以期為臨床上糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療提供理論基礎(chǔ)，為以糖尿病新藥的研發(fā)提供新的靶點。

1 材料方法

1.1 實驗動物及主要試劑和儀器 選取40只6～7周的無特定病原體級雄性SD大鼠，體重(197.5±11.4)g，隨機血糖(6.55±0.75)mmol/L，購自四川大學實驗動物中心，動物的許可證號：SCXK(川)2018-026。鏈脲佐菌素購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司(批號：20191124)；金芪降糖片購自天津中新藥業(yè)集團股份有限公司(批號：20200426)；黃芪黃酮由四川大學藥物分析代謝實驗室提取；蛋白酶K工作液購自上海尚寶生物有限公司(批號：20190610)；脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP 缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測探針JC-1試劑盒均購自中國碧云天公司(批號分別為：20191213、20200426、20201002)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛試劑盒均購自江蘇凱基生物公司(批號分別為：20200113、20191206)；細胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B細胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma-2-associated X protein，Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved Caspase3)、p38和磷酸化p38(phosphorylated p38,p-p38)抗體均購自美國Abcam公司，批號分別為(ab1809、ab4693、ab4062、ab2984、ab5535、ab9802)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因購自博士德生物公司(批號：D8327)；ECL顯色液購自南京凱基生物科技有限公司(批號：22678)；ZJL859BTT型血糖儀購自上海強生醫(yī)療器械有限公司；Von Frey電子測痛儀購自美國IITC。

1.2 造模及分組 給予大鼠自由飲水、自由采食，室內(nèi)自然光照，室溫18℃～20 ℃，分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只。適應(yīng)性飼喂1 周后，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組10只和模型組30只。造模前12～16 h禁食、不禁水，模型組大鼠按照52 mg/kg一次性腹腔注射2 %的鏈脲佐菌素，正常對照組腹腔注射等量枸櫞酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，60 mg/kg，pH 4.5)。造模后第7 d使用血糖儀檢測模型組大鼠尾尖血血糖，隨機血糖>16.7 mmol/L即為造模成功。將造模成功的30只大鼠采用分層隨機法分為模型組、黃芪黃酮組和陽性對照組，每組10只。

1.3 給藥劑量及方法 造模成功后即日開始灌胃給藥。黃芪黃酮組給藥量按照成人每日服用黃芩生藥量60 g/體質(zhì)量(成人按照60kg體重)計算，大鼠黃芩等效劑量為成人6.3倍(依據(jù)體表面積換算)，灌胃給藥濃度為1 mL溶液中含黃芩生藥量1 g，給藥劑量相當于黃芩生藥量6.3 g/kg，即黃芪黃酮給藥量為0.04 g/kg；陽性對照組給予金芪降糖片(455 mg/kg)進行灌胃；正常對照組及模型組灌服等量蒸餾水。所有大鼠灌胃均為1 d/次。為了防止由于血糖過高大鼠無法存活至實驗結(jié)束，模型組大鼠腹腔皮下注射1～4 IU/d的精蛋白鋅胰島素注射液(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：39847920)，使血糖平穩(wěn)在20.0～25.0 mmol/L。連續(xù)觀察30 d。

1.4 大鼠機械痛閾值測定 造模后30 d后，在各組大鼠處死前，使用血糖儀檢測各組大鼠尾尖血血糖。同時，使用Von Frey儀測量大鼠機械疼痛閾值：將大鼠放置在升高的金屬網(wǎng)上，蓋上透明的有機玻璃罩。大鼠在環(huán)境中適應(yīng)15 min后，使用Von Frey電子儀垂直刺激(電壓30 V)大鼠后肢足底中部，使探頭纖維稍呈S形。大鼠在受到刺激后出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，記為陽性反應(yīng)，記錄儀器電子屏幕上的受力數(shù)值(g)。由于身體的活動出現(xiàn)的縮足反應(yīng)不記為陽性反應(yīng)(刺激后快速縮足反應(yīng)即為陽性反應(yīng))。測量1次后相隔3～5 min再次測量，每只大鼠實驗重復3次，取平均值。

1.5 標本處理 干預30 d后各組大鼠給予腹腔注射10 mg/kg的12%烏拉坦(齊魯制藥有限公司，批號：190319)進行麻醉，將大鼠仰臥位固定于動物無菌手術(shù)臺，固定脊椎，股部剪毛，找到坐骨神經(jīng)，沿坐骨神經(jīng)找到膨大的背根神經(jīng)節(jié)，取出神經(jīng)節(jié)組織，置于凍存管中于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.6 細胞凋亡檢測 37 ℃條件下使用蛋白酶K工作液(武漢博士德生物工程有限公司，批號：1069832)處理背根神經(jīng)節(jié)組織(3～5 g)15 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)漂洗3次，15 min/次。樣本干燥后，在冰上使用破膜劑處理組織2 min，滴加50 μL TUNEL反應(yīng)工作液，濕盒中37℃反應(yīng)1 h；15℃～25 ℃條件DMEM培養(yǎng)箱孵育10 min；然后PBS漂洗3次，15 min/次，加入10 mg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，室溫環(huán)境下預染細胞核5 min，PBS漂洗2次，30 s/次。在激光共聚焦顯微鏡(北京普瑞賽司儀器有限公司，型號：LSM 900)下觀察，出現(xiàn)綠色熒光為凋亡細胞，藍色熒光為細胞核。每組隨機選擇5個視野(×100)，計算各組凋亡細胞數(shù)。細胞凋亡率=綠色熒光的凋亡細胞數(shù)/藍色熒光的凋亡細胞數(shù)×100%。

1.7 ROS、丙二醛和SOD含量檢測 取各組大鼠神經(jīng)節(jié)組織50 mg，加入1 mL勻漿緩沖液，用勻漿器充分勻漿，3 000 r/min 4℃離心10 min，取上清。采用比色法檢測ROS含量，采用硫代巴比妥酸法檢測丙二醛含量，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD含量，檢測均按照試劑盒說明嚴格操作。

1.8 線粒體膜電位檢測 取各組大鼠神經(jīng)節(jié)組織500 mg，PBS清洗背根神經(jīng)節(jié)3次，30 s/次，37 ℃胰酶消化45 min，然后使用巴士吸管吹打5 min，按照JC-1試劑盒說明裝載熒光探針，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min。孵育期間每3～5 min顛倒混勻1次，以使背根神經(jīng)節(jié)細胞與熒光探針能夠充分接觸。PBS洗滌細胞3次，5 min/次，將未進入細胞內(nèi)的JC-1探針充分去除。熒光顯微鏡(美國Nexcope，型號：NE620)下觀察并計量熒光強度，以紅色熒光/綠色熒光的比值表示膜電位，比值高則線粒體膜電位水平升高，比值低則線粒體膜電位水平降低。紅色熒光多則說明細胞活性大。

1.9 Cyt-C、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase3、p38和p-p38蛋白相對表達量檢測 采用蛋白免疫印跡法檢測蛋白相對表達量。取各組大鼠神經(jīng)節(jié)組織200 mg，加入適量裂解液(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：89893)，冰上反應(yīng)30 min， 3 000 r/min、4℃離心10 min，移液器吸取上清，保存。采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。蛋白與上樣緩沖液按照1 ∶4混勻，100 ℃沸水變性5 min。按照40 μg/孔加變性蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉膜后，加一抗(1 ∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，PBS洗膜3次，5 min/次；加二抗(艾美捷科技有限公司，批號：PAB31742；稀釋比例1 ∶2 000)，37 ℃孵育2 h，PBS洗膜3次，5 min/次；膜上滴加ECL顯色液，曝光、顯影、定影，采用Image J軟件分析灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值為各蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用(x±s)表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠血糖及機械痛閾值的比較 4組大鼠造模后第7天和第30天的血糖均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中其他3組的血糖均高于正常對照組，而黃芪黃酮組和陽性對照組血糖均低于模型組(均P<0.05)。4組大鼠的機械痛閾值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中機械痛閾值由高到低為正常對照組>黃芪黃酮組>陽性對照組>模型組(均P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠血糖及機械痛閾值的比較(x±s)

2.2 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率的比較 凋亡細胞核呈棕黃色，對照組凋亡細胞較少，模型組凋亡細胞較多，黃芪黃酮組和陽性對照組凋亡細胞較模型組少，見圖1。4組大鼠的背根神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中背根神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率由高到低為模型組>陽性對照組>黃芪黃酮組>正常對照組(均P<0.05)。見表2。

圖1 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡情況(DAPI染色，×100)

表2 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率的比較(x±s，%)

2.3 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織ROS、丙二醛和SOD含量的比較 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織ROS、丙二醛和SOD含量的比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。其中，與正常對照組比較，模型組背根神經(jīng)節(jié)組織的ROS和丙二醛含量均升高，SOD含量降低(均P<0.05)；與模型組比較，黃芪黃酮組和陽性對照組背根神經(jīng)節(jié)組織的ROS和丙二醛含量降低，SOD含量明顯升高(均P<0.05)；黃芪黃酮組背根神經(jīng)節(jié)組織的ROS和丙二醛含量低于陽性對照組，SOD含量高于陽性對照組(均P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織ROS、丙二醛和SOD含量的比較(x±s)

2.4 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)膜電位水平的比較 4組膜電位水平由高到低為正常對照組>黃芪黃酮組>陽性對照組>模型組(均P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)膜電位水平的比較(x±s)

2.5 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織Cyt-C、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase3、p38及p-p38蛋白相對表達量的比較 正常對照組、黃芪黃酮組、陽性對照組、模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織的Cyt-C、Bax、p38及p-p38蛋白相對表達量均依次升高(均P<0.05)。與正常對照組比較，其他3組背根神經(jīng)節(jié)組織的cleaved Caspase3蛋白相對表達量升高，Bcl-2蛋白相對表達量降低(均P<0.05)；而與模型組比較，黃芪黃酮組和陽性對照組背根神經(jīng)節(jié)組織的cleaved Caspase3蛋白相對表達量降低，Bcl-2蛋白相對表達量升高(均P<0.05)，但黃芪黃酮組和陽性對照組間差異無統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖2～3和表5。

圖2 4組神經(jīng)節(jié)組織Cyt-C、Bcl-2、Bax 和cleaved Caspase3蛋白表達情況

表5 4組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織的Cyt-C、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase3、p38及p-p38蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖3 4組神經(jīng)節(jié)組織p38和p-p38蛋白表達情況

3 討 論

痛熱閾值檢測、神經(jīng)電生理檢查及神經(jīng)病理學觀察是評定糖尿病周圍神經(jīng)病變動物模型是否成功及嚴重程度的主要方法。研究證實，鏈脲佐菌素制備的糖尿病大鼠模型成功后4～8周即可觀察到與人類糖尿病周圍神經(jīng)病變相似的變化，包括痛溫覺異常、髓鞘腫脹、神經(jīng)傳導速度減慢等[6-8]。本研究選擇52 mg/kg的鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，結(jié)果顯示造模7 d 后模型組大鼠的血糖高于正常對照組，且造模30 d模型組大鼠的機械痛閾值低于正常對照組(均P<0.05)，說明糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠模型建立成功。黃芪黃酮組的機械痛閾值和血糖均低于模型組(P<0.05)，提示黃芪黃酮有助于改善糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠的病情。

研究表明，在糖尿病周圍神經(jīng)病變眾多發(fā)病機制中，氧化應(yīng)激占有重要位置，氧化應(yīng)激可能是糖尿病并發(fā)癥產(chǎn)生的一個核心機制[9-10]。有研究顯示，在糖尿病狀態(tài)下背根神經(jīng)節(jié)中過氧化物、氧離子增多[11-12]。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所，線粒體內(nèi)ROS過量產(chǎn)生可引起線粒體內(nèi)膜發(fā)生去極化，線粒體膜電位降低，膜通透性增加，Cyt-C等凋亡相關(guān)蛋白釋放至胞質(zhì)，進而與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)9和凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合，Caspase9活化后進一步激活Caspase3，最終引起細胞的凋亡[13-14]。Cyt-C與膜電位是導致線粒體細胞凋亡的兩個關(guān)鍵指標，而Caspase3是凋亡的執(zhí)行者。cleaved Caspase3 可降解細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，誘導細胞死亡，Caspase3處于Caspase級聯(lián)反應(yīng)的末端，并被細胞凋亡的內(nèi)在和外在死亡途徑激活，活化的Caspase3可降解細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，誘導細胞死亡。Bcl-2和Bax皆為Bcl-2家族成員，分別發(fā)揮抑凋亡和促凋亡的作用，其中Bcl-2主要定位于線粒體外膜上，可降低線粒體膜滲透性，從而控制線粒體Cyt-C釋放[15-16]。王超等[17]的研究顯示，高糖可引起大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞活性降低，細胞凋亡增加，ROS含量升高，而筋脈通可以減弱高糖對細胞活力、凋亡及ROS的影響。倪洪崗等[18]研究發(fā)現(xiàn)，糖痹康可以降低糖尿病大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)ROS含量及細胞凋亡率，抑制Bcl-2表達，增強Caspase3表達。提示中藥對血糖水平具有調(diào)控作用。丙二醛可間接反映細胞的損傷程度及自由基代謝變化，聯(lián)合測定SOD和丙二醛，可用于反映機體清除氧自由基的能力[19]。有研究顯示，黃芪黃酮可明顯降低糖尿病大鼠模型血清丙二醛含量，提高血清SOD含量[20]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠的背根神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率增加，背根神經(jīng)節(jié)組織的ROS、丙二醛含量以及Cyt-C、Bax、cleaved Caspase3蛋白表達水平升高，背根神經(jīng)節(jié)組織的SOD含量、Bcl-2蛋白表達水平及膜電位水平降低；而黃芪黃酮組大鼠的背根神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率，背根神經(jīng)節(jié)組織的ROS、丙二醛含量以及Cyt-C、Bax 和cleaved Caspase3蛋白表達水平均低于模型組，背根神經(jīng)節(jié)組織的SOD含量、Bcl-2蛋白表達水平及膜電位水平均高于模型組(均P<0.05)。以上結(jié)果提示黃芪黃酮可能通過抑制背根神經(jīng)節(jié)組織氧化應(yīng)激反應(yīng)及細胞凋亡從而對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠起保護作用。p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是MAPK家族成員之一，有誘導神經(jīng)細胞凋亡的作用，p38MAPK信號通路參與了神經(jīng)病變的發(fā)生和發(fā)展[21]。有研究顯示，高糖所致ROS大量產(chǎn)生可引起p38MAPK信號通路的激活，p38MAPK又可通過進一步調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase3表達，最終引起神經(jīng)元細胞的凋亡[22]。有研究表明，黃芪黃酮可明顯降低糖尿病大鼠胰腺中p38 mRNA的表達[23]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組背根神經(jīng)節(jié)組織的p38及p-p38蛋白相對表達量升高(均P<0.05)，說明高糖可促進背根神經(jīng)節(jié)組織p38及p-p38表達；而黃芪黃酮組背根神經(jīng)節(jié)組織的p38及p-p38蛋白相對表達量均低于模型組(均P<0.05)，提示p38MAPK可能是黃芪黃酮抑制背根神經(jīng)節(jié)組織細胞凋亡的途徑之一。此外，本研究結(jié)果顯示，黃芪黃酮組的機械痛閾值、氧化應(yīng)激指標、細胞凋亡率及部分凋亡相關(guān)蛋白的表達、膜電位水平、p38和p-p38蛋白的表達均優(yōu)于陽性對照組(P<0.05)，提示黃芪黃酮對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織的保護作用優(yōu)于傳統(tǒng)藥物金芪降糖片。

綜上所述，黃芪黃酮可抑制糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織氧化應(yīng)激、細胞凋亡，以及p38MAPK信號通路，從而減輕周圍神經(jīng)損傷。本研究為黃芪黃酮在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)，值得進一步深入探究。