蘭科植物多倍體誘導(dǎo)研究進(jìn)展

羅遠(yuǎn)華， 方能炎， 樊榮輝， 黃敏玲

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究中心/福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心，福建福州 350013)

蘭科(Orchidaceae)植物是開花植物中僅次于菊科(Asteraceae)的第二大科，目前已確認(rèn)的有736屬28 000種，廣泛分布于除兩極和干旱沙漠地區(qū)以外的區(qū)域，主要生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)。蘭科植物不僅具有極高的觀賞價值，不少種類如鐵皮石斛()、金線蓮()等也具有較高的藥用價值。

多倍體是指體細(xì)胞中含有3個或者3個以上完整染色體組的生物體，多倍體現(xiàn)象在高等植物中普遍存在，是驅(qū)動植物進(jìn)化和物種形成的主要動力之一。多倍體育種手段比較簡單，育出的品種不僅在表型性狀、次生代謝物的積累以及抗逆性等方面具有較多的優(yōu)點(diǎn)，而且還能有效克服遠(yuǎn)緣雜交不親和等特點(diǎn)，因此應(yīng)用較為廣泛。多倍體現(xiàn)象在蘭科植物中普遍存在，但自然加倍的發(fā)生頻率低，難以滿足生產(chǎn)實(shí)踐。近年來，國內(nèi)外在蘭科植物多倍化研究方面較為深入和廣泛。到目前為止，已開展了蘭科植物中至少16個屬的人工誘導(dǎo)多倍體研究(表1)，部分誘導(dǎo)獲得的多倍體已在生產(chǎn)中得到應(yīng)用。本文主要總結(jié)了近20年來蘭科植物多倍體誘導(dǎo)的研究進(jìn)展，旨在為蘭科植物多倍體育種提供參考。

表1 2000—2020年已誘導(dǎo)獲得多倍體的主要蘭科植物

1 蘭科植物多倍體誘導(dǎo)

1.1 誘變材料的選擇

蘭科植物同其他植物一樣，在誘導(dǎo)多倍體時應(yīng)選擇分裂旺盛的組織作為誘變材料，主要有種子、胚狀體、原球莖、類原球莖、根狀莖、莖尖、不定芽、叢生芽、帶節(jié)莖段等(表2)。誘變材料在很大程度上決定了誘變的效率，因此須要根據(jù)種類的不同選擇適宜的誘變材料。相同材料由于誘變材料的差異也會影響誘導(dǎo)率，篩選適宜的誘變材料是成功獲得多倍體的基礎(chǔ)。以秋水仙素(colchicine)為誘導(dǎo)劑進(jìn)行浸泡處理誘導(dǎo)鐵皮石斛()多倍體研究時，張靜靜分別以種胚、類原球莖、帶節(jié)莖段為材料，誘導(dǎo)率分別為40.0%、40.0%、30.0%；吳睿以原球莖和叢生芽為材料，再生植株多倍體誘導(dǎo)率分別為16.7%、13.3%；張青華等以類原球莖、叢生芽為材料，誘導(dǎo)率分別為26.0%、48.0%。

表2 蘭科植物多倍體誘導(dǎo)研究進(jìn)展

表2(續(xù))

1.2 誘變劑種類的選擇

多倍體化學(xué)誘導(dǎo)的原理是利用抗微管藥物與分裂細(xì)胞的微管蛋白結(jié)合，迫使細(xì)胞有絲分裂中斷，使姐妹染色單體不能移向細(xì)胞兩級，從而產(chǎn)生染色體組數(shù)加倍的細(xì)胞。在蘭科植物多倍體誘導(dǎo)中，秋水仙素的應(yīng)用最為廣泛(表2)。但秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍時需要較高的濃度，因此對植物材料的傷害較大，且價格較昂貴，因此育種專家們一直在嘗試使用其他誘變劑。

安磺靈、二甲戊靈、甲基胺草磷等與秋水仙素的作用機(jī)制一致，這些藥劑甚至對植物微管蛋白的親和性更高，在蘭科植物中應(yīng)用越來越廣泛。Hwang等比較了秋水仙素和安磺靈對大花蕙蘭的誘導(dǎo)效果，采用0.05 g/L秋水仙素浸泡處理7 d，誘導(dǎo)率為60.0%；采用0.005 g/L秋水仙素浸泡處理 14 d，誘導(dǎo)率為46.7%。Chung等也比較了秋水仙素和安磺靈對蝦脊蘭雜交F種子的誘導(dǎo)效果，采用0.10 g/L秋水仙素浸泡處理7 d，誘導(dǎo)率為81.0%；采用0.03 g/L安磺靈浸泡處理1 d的誘導(dǎo)率為86.0%。滕人達(dá)比較了秋水仙素和二甲戊靈對金線蓮的誘導(dǎo)效果，采用0.09 g/L二甲戊靈浸泡處理48 h，存活率為56.7%，誘導(dǎo)率為50.0%；而采用0.70 g/L秋水仙素浸泡處理24 h，存活率為50.0%，誘導(dǎo)率為43.3%，二甲戊靈使用濃度較低，但誘導(dǎo)效率優(yōu)于秋水仙素。除使用一種誘變劑外，還可以混用2種誘變劑誘導(dǎo)多倍體。李秀蘭等采用附加了0.1 g/L 秋水仙素與0.005 g/L安磺靈的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)8～10 d，秋石斛四倍體誘導(dǎo)率達(dá)到90%以上。

1.3 處理方法、誘變劑濃度與時間

1.3.1 處理方法 蘭科植物多倍體誘導(dǎo)方法有浸泡法、混培法和涂抹法等，其中以浸泡法和混培法應(yīng)用較多(表2)。浸泡法能使誘變劑充分接觸誘變材料，能減少嵌合體的發(fā)生，但對材料傷害較大，處理時間不宜過長?；炫喾ㄊ菍⒄T變材料接種到添加了誘變劑的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時間后轉(zhuǎn)移到常規(guī)培養(yǎng)基中?；炫喾ㄖ姓T變劑濃度一般較小，對材料傷害較小，但處理時間一般較長。何碧珠等研究了不同處理方法對金線蓮多倍體的誘導(dǎo)效果，結(jié)果表明混培法最優(yōu)，浸泡法次之，涂抹法較差。卓孝康也比較了不同處理方法對大苞鞘石斛多倍體的誘導(dǎo)效果，1.0 g/L秋水仙素浸泡處理12 h的誘導(dǎo)率為26.0%，而采用0.3 g/L秋水仙素混培處理30 d的誘導(dǎo)率達(dá)34.0%，但認(rèn)為混培法中誘變劑使用濃度雖低，但較浸泡法處理的時間更長，經(jīng)多代培養(yǎng)后的植株生長性狀仍表現(xiàn)出明顯的毒副作用，這與夏春英的研究結(jié)果一致。

1.3.2 誘變劑濃度與處理時間 研究表明，當(dāng)處理時間一定時，誘變材料的死亡率隨誘變劑濃度的升高呈不斷增加的變化趨勢；當(dāng)誘變劑濃度一定時，隨處理時間的延長誘變材料的死亡率也不斷上升。適宜的誘變劑濃度及處理時間是蘭科植物多倍體成功誘導(dǎo)的關(guān)鍵。蘭科植物多倍體誘導(dǎo)中，秋水仙素使用的最低濃度為0.000 6 g/L，最高使用濃度為30.000 0 g/L，使用較多的濃度范圍在0.05～2.00 g/L之間；安磺靈使用的適宜濃度范圍比較集中，主要在0.005～0.030 g/L之間；二甲戊靈和甲基胺草磷應(yīng)用較少，適宜濃度分別為0.05～0.09 g/L 和0.01 g/L。秋水仙素浸泡法處理的最短時間是30 min，最長時間是 13 d，使用較多的時間范圍在12 h至7 d；秋水仙素混培法處理的時間范圍是3～120 d。安磺靈處理的時間范圍是48 h至14 d，二甲戊靈處理的時間范圍是48 h至 8 d，甲基胺草磷處理的時間范圍是12～48 h。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)設(shè)置適宜的誘變劑濃度梯度和處理時間梯度，并結(jié)合誘變材料的死亡率、多倍體誘導(dǎo)率以及生長情況，探索適宜不同品種的最佳組合。

2 蘭科植物多倍體鑒定

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

株高、莖粗、節(jié)間長、葉長、葉寬、葉色、根粗、葉脈等可作為鑒別蘭科植物多倍體的重要形態(tài)指標(biāo)。研究表明，蘭屬植物誘導(dǎo)獲得的多倍體，植株矮壯，葉片變厚、變寬，葉長、葉形指數(shù)變小，葉色深綠，但葉片易扭曲、畸形，生長緩慢；石斛屬植物誘導(dǎo)獲得的多倍體植株多矮壯，節(jié)間短、葉片加厚、葉色深綠，但葉片易折斷，生長緩慢；開唇蘭屬植物多倍體植株更高大，莖段粗壯、節(jié)間加長、葉片變大、葉片肥厚、葉色深、根粗壯，但生長緩慢。

2.2 細(xì)胞學(xué)鑒定

蘭科植物多倍體植株的氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞變大，單位葉面積氣孔數(shù)減少，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體大且顏色較深，保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)增多，葉綠素含量明顯增加。氣孔密度、氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞的大小及保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體大小與數(shù)量等可作為鑒別蘭科植物二倍體和多倍體的重要指標(biāo)。

2.3 染色體計數(shù)鑒定

染色體計數(shù)是最直接、最有效的植物倍性鑒定方法。蘭科植物多倍體染色體數(shù)量鑒定中，主要以根尖為材料進(jìn)行常規(guī)壓片法鑒定，但在對金線蓮的倍性鑒定時，賴紅英等以莖尖為材料，鑒定出了多倍體植株的染色體數(shù)量。染色體計數(shù)法雖然方法步驟較簡單，但對操作技術(shù)具有較高的要求。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的用于快速測定細(xì)胞核內(nèi)DNA含量和細(xì)胞核大小的技術(shù)，是現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)常用的細(xì)胞分選技術(shù)。目前，流式細(xì)胞術(shù)在蘭科植物基因組大小測定、染色體倍性鑒定和內(nèi)多倍性研究等方面得到廣泛應(yīng)用。目前，利用流式細(xì)胞術(shù)在蘭屬、石斛屬、開唇蘭屬、新堇蘭屬、兜蘭屬、蝴蝶蘭屬、蝦脊蘭屬、白芨屬、文心蘭屬、苞舌蘭屬等蘭科植物的人工多倍體誘導(dǎo)鑒定中得到廣泛應(yīng)用，同時也應(yīng)用于手參屬()、掌裂蘭屬()等蘭科植物的多倍體進(jìn)化研究中。

3 蘭科植物多倍體誘導(dǎo)的意義

3.1 提高觀賞性

多倍體植物的表型通常具有巨大性，因此有望通過多倍體育種培育出花朵更大、花瓣變多、花色變深、花質(zhì)厚重的蘭花新品種。同時多倍體還具有植株粗壯、葉片寬厚、葉色濃綠等特征，從而調(diào)節(jié)株型，提高整體觀賞價值。廖道龍等研究表明，隨著倍性的增加，石斛屬植物的葉片呈增長、增寬、增厚，花朵直徑呈增大、花瓣增厚的趨勢，莖粗呈增大的變化趨勢，其中四倍體的花朵直徑、莖粗顯著大于二倍體和三倍體。謝利等研究表明，隨著倍性的增加，蝴蝶蘭花朵直徑逐漸增大，四倍體的花朵直徑顯著大于三倍體和二倍體，但花朵數(shù)量顯著少于二倍體和三倍體，三倍體花朵數(shù)量最多。

3.2 克服遠(yuǎn)緣雜交障礙

在雜交之前先使某一親本加倍成同源多倍體，可克服雜交不親和，提高雜交結(jié)實(shí)率。遠(yuǎn)緣雜種F，在減數(shù)分裂過程中大量的單價體會導(dǎo)致嚴(yán)重的不育，通過染色體加倍后獲得的異源多倍體可恢復(fù)生育能力。多倍體的近親繁殖抑制程度也低于二倍體親本，因此能夠容忍更高水平的自交。人工誘變獲得的多倍體類型一般僅能作為育種中間材料，在進(jìn)一步進(jìn)行雜交、回交等利用時，還需保持和提高目標(biāo)性狀才可能選育出商業(yè)品種。值得一提的是，如獲得的蘭科植物多倍體具有良好的商品性，則可通過無性繁殖的途徑快速固定并繁殖，直接進(jìn)行市場化應(yīng)用。

3.3 提高抗逆性

同源多倍體降低了突變和隱性基因純合表現(xiàn)可能性以及異源多倍體中等位基因雜合性，利于其內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定，能提高遺傳多樣性和適應(yīng)能力，因此多倍體對不良環(huán)境具有更強(qiáng)的抵抗力，具有強(qiáng)大的生長優(yōu)勢和良好的開發(fā)利用前景。陳曉梅研究認(rèn)為，蕙蘭葉綠素含量隨倍性的增加而增加，相較于二倍體，四倍體蕙蘭植株的耐寒性和抗旱性均提高。吳姝漪研究表明，高溫脅迫下四倍體華石斛較二倍體的葉綠素含量(SPAD值)和相對電導(dǎo)率變化都更平緩，且四倍體出現(xiàn)高溫脅迫的時間更晚，推斷出四倍體華石斛的耐熱性更強(qiáng)。周珊珊等研究表明，大花蕙蘭多倍體類原球莖抵御低溫和高溫能力強(qiáng)于二倍體，多倍體中抗氧化酶系(SOD、POD、CAT)活性及丙二醛含量的變化是導(dǎo)致多倍體抗性增強(qiáng)的重要原因。王園園研究表明，高溫脅迫下四倍體雜交蘭葉綠素含量的降幅小于二倍體，丙二醛含量及增幅也小于二倍體，而脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的增幅均大于二倍體，研究證明四倍體較二倍體具有更強(qiáng)的抗逆性。

3.4 提高次生代謝物含量

鐵皮石斛、金線蓮等蘭科藥用植物的功效成分主要為糖類、茋類、酚類、萜類、生物堿類、黃酮類和甾醇類等，其中主要由甘露糖和葡萄糖等單糖構(gòu)成的水溶性多糖是其重要活性成分之一。蘭科植物加倍后往往能提高其體內(nèi)能源物質(zhì)與活性成分的含量。研究表明，鐵皮石斛同源四倍體中葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、多糖的含量顯著高于二倍體。多倍體金線蓮的多糖、總黃酮含量均高于二倍體植株。霍山石斛四倍體的根、莖、葉中多糖、生物堿的含量均高于二倍體，二倍體和四倍體中參與多糖、萜類、聚酮類、氨基酸等代謝及激素合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵基因的差異表達(dá)，可能是四倍體植株體內(nèi)能源物質(zhì)含量增加、活性成分提高和生長勢增強(qiáng)的主要原因。此外，王園園比較鑒定了二倍體、四倍體雜交蘭的生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)四倍體植株中可溶性糖和蛋白質(zhì)含量均顯著高于二倍體。

4 主要問題與展望

4.1 嵌合體的分離

多倍體誘導(dǎo)中無論采用何種材料與誘變方法，常伴有大量的嵌合體。誘變獲得的嵌合體植株不能穩(wěn)定遺傳，因此需要對嵌合體進(jìn)行鑒定、分離與純化。一直以來，蘭科植物嵌合體的分離與純化極其困難。隨著組織培養(yǎng)與多倍體育種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，多倍體誘導(dǎo)中的嵌合體問題正逐步得到解決。準(zhǔn)確地掌握適宜不同材料的誘變劑濃度、處理時間和處理方法，在提高多倍體誘變效率的同時，采用有效的嵌合體分離方法是成功獲得多倍體的關(guān)鍵。組織連續(xù)切割分離法是嵌合體分離常用的方法之一。李涵等采用不定芽結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)，多倍體誘導(dǎo)后通過不斷切割、培養(yǎng)產(chǎn)生新的個體，成功獲得了部分穩(wěn)定的多倍體植株材料。孫紅梅等研究表明，以體細(xì)胞胚發(fā)生體系進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)可有效減少嵌合體形成。對于蘭科植物而言，以種子誘導(dǎo)出的原胚期原球莖、種胚或體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得的胚狀體、類原球莖等都是處于尚未分化的母細(xì)胞階段，進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)時一旦加倍成功后將發(fā)育成多倍體原球莖或類原球莖，進(jìn)一步再分化便可獲得大量多倍體幼苗，能提高多倍體純合體的選擇效率。

4.2 多倍體的繁殖

多倍體植株通常生長發(fā)育緩慢。尹翠翠等研究表明，加倍后的雜交蘭雖然生長緩慢，但通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基營養(yǎng)組成及生長調(diào)節(jié)劑的濃度，獲得了正常生長的四倍體無菌苗。吳姝漪研究表明，華石斛四倍體與二倍體具有相同的增殖效果，且增殖后的四倍體幼苗生長健壯。劉靜雯等系統(tǒng)研究并建立了鐵皮石斛同源四倍體工廠化快繁工藝；李丹丹研究篩選出了適宜鐵皮石斛同源四倍體的栽培基質(zhì)配方，為鐵皮石斛同源四倍體種質(zhì)的生產(chǎn)推廣提供了技術(shù)支撐?？傮w而言，針對蘭科植物多倍體繁育的研究還不夠深入，系統(tǒng)研究并建立適宜的繁殖技術(shù)體系是提高多倍體利用效率的重要環(huán)節(jié)。