我國人參灰霉病菌對3種化學殺菌劑的抗藥性△

陳炳蔚，李勇，王蓉，丁萬隆

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京100193

灰葡萄孢Botrytis cinereaPers 為核盤菌科（Sclerotiniaceae）葡萄孢盤菌屬（Botrytis）病原真菌，其適應性強、寄主范圍廣，能侵染草莓、葡萄、番茄等1000 余種植物[1-2]，引起猝倒、爛葉、爛果、花腐等癥狀。1984 年，由灰葡萄孢引起的人參灰霉病在我國渾北河口參場被首次發(fā)現(xiàn)。此后，我國及韓國人參主產區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)人參灰霉病[3-5]。近年，灰霉病在我國人參主產區(qū)流行成災，造成人參莖葉腐爛及果實脫落，對整個人參產業(yè)影響較大[6]。

目前，灰霉病主要依賴化學防治，常用殺菌劑包括苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯氨基嘧啶類等[7]。由于長期頻繁使用，灰霉病菌已對上述殺菌劑產生了不同程度的抗藥性[8-10]。迄今，人參灰霉病菌抗藥性研究鮮有報道。Kim 等[11]發(fā)現(xiàn)韓國人參灰霉病對多菌靈的抗性頻率高達96.6%；Lu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，吉林撫松人參灰霉病菌對多菌靈、嘧霉胺和異菌脲的抗性頻率分別達到81.6%、46.1%和31.6%。

近年來，我國人參主產區(qū)灰霉病呈現(xiàn)高發(fā)成災態(tài)勢。然而，由于缺乏對我國人參主產區(qū)灰霉病菌抗藥性的整體了解，人參灰霉病防治存在較大的盲目性。大量“無效”化學農藥的使用不僅無助于灰霉病防治，還會造成嚴重的環(huán)境污染，加劇人參農藥殘留。為此，在課題組前期完成我國人參主產區(qū)灰霉病菌采集及分離基礎上，本研究對上述灰霉病菌開展室內抗藥性實驗，進一步明確我國人參灰霉病菌整體抗藥性水平、抗藥性菌株組成及地域分布特征，為制定科學高效的人參灰霉病害防控策略、有效減輕人參產區(qū)生態(tài)環(huán)境污染及人參農藥殘留、遏制高抗藥性灰霉菌株產生風險提供重要參考。

1 材料

1.1 菌株

供試102 株人參灰霉病菌于2018 年從人參主產區(qū)的人參灰霉病葉上分離獲得。其中，黑龍江、吉林和遼寧人參灰霉病菌分別為36、45、21株[13]。

1.2 儀器

SPX-15C 型生化培養(yǎng)箱（中儀國科科技有限公司）；BSC-1100ⅡA2 型生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；ME204 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LX-B35L 型蒸汽滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設備有限公司）。

1.3 試藥

多菌靈（批號：RNA391，純度≥98%）、異菌脲（批號：ATZ378，純度：96%）、嘧霉胺（批號：AZSZ794，純度：98%）均購于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar medium，PDA）培養(yǎng)基（批號：20200310，北京奧博星生物技術有限公司）；七水硫酸鎂（批號：1907061，純度≥99%）、磷酸氫二鉀（批號：1905061，純度≥99%）、氯化鉀（批號：1908061，分析純）、七水硫酸亞鐵（批號：1903061，純度≥99%）均購于西隴科學股份有限公司；L-天冬酰胺（L-asparagine agar medium，ASP，批號：20190325，純度≥99%）、葡萄糖（批號：20200828，純度≥99.5%）、瓊脂粉（批號：20200604）均購于北京百瑞極生物科技有限公司；丙酮（批號：20200708）、鹽酸（批號：20200614）均購于北京市通廣精細化工公司；水為蒸餾水。

2 方法

2.1 殺菌劑母液制備

取多菌靈2.5 g，逐滴加入10 mol·L-1鹽酸，全部溶解后置50 mL 量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，配制成50 mg·mL-1的多菌靈母液。取異菌脲1.5 g置50 mL 量瓶中，加丙酮定容至刻度，搖勻溶解后配制成30 mg·mL-1的異菌脲母液。取嘧霉胺1.5 g置50 mL 量瓶中，加丙酮定容至刻度，搖勻溶解后配制成30 mg·mL-1的嘧霉胺母液。

2.2 含藥培養(yǎng)基制備

取PDA 培養(yǎng)基干粉37 g，加蒸餾水定容至1000 mL，高溫滅菌，作為PDA 培養(yǎng)基備用。

取七水硫酸鎂1 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、七水硫酸亞鐵0.01 g、ASP 2 g、葡萄糖22 g、瓊脂粉15 g，加蒸餾水定容至1000 mL，高溫滅菌，作為ASP 培養(yǎng)基備用。

參考文獻[14-16]方法，將母液按比例加入培養(yǎng)基中制成含藥平板。平板中殺菌劑質量濃度根據(jù)前期預實驗結果調整（表1）。

表1 培養(yǎng)基及殺菌劑質量濃度

2.3 殺菌劑對灰霉病菌的半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）檢測及抗藥性水平評價

采用菌絲生長速率法測定人參灰霉病菌對3 種化學殺菌劑的敏感性。在生物安全柜中從預先培養(yǎng)好的灰霉菌菌落上取直徑5 mm菌餅，接種于含藥平板中央，以不含殺菌劑的平板作為空白對照。每個處理3 次重復。接種好的平板置于生化培養(yǎng)箱中25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d 后測量菌落直徑，按公式（1）計算菌絲生長抑制率。

將生長抑制率轉換成幾率值（Y）、藥劑質量濃度轉換成以10 為底的對數(shù)值（X），求毒力回歸方程Y=aX+b 和r，計算出殺菌劑對供試菌株菌絲生長的EC50[14]。人參灰霉菌對多菌靈、異菌脲和嘧霉胺的抗性水平按參考文獻[15,17-18]，并適當調整（表2）。

表2 人參灰霉病菌抗性鑒別標準μg·mL-1

2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)DPS 9.01 用于殺菌劑對人參灰霉病菌菌絲生長的抑制率分析；SPSS 20.0用于判斷不同地區(qū)間EC50的差異是否有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 人參灰霉病菌對多菌靈的抗性水平

由表3可知，供試102株人參灰霉病菌均對多菌靈表現(xiàn)高抗藥性（EC50＞640 μg·mL-1），不同產區(qū)人參灰霉病菌對多菌靈的抗藥性差異無統(tǒng)計學意義。多菌靈在640 μg·mL-1時對人參灰霉病菌的抑制率為0～41.86%，平均抑制率為14.99%。遼寧本溪人參灰霉病菌對多菌靈最敏感，抑制率為41.86%；黑河、靖宇、通化人參灰霉病菌在該質量濃度含藥平板上生長正常，與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義。

表3 多菌靈對人參灰霉病菌生長的抑制情況

3.2 灰霉病菌對異菌脲的抗性水平

根據(jù)異菌脲抗性將供試人參灰霉病分為敏感、低抗、中抗3個等級（表4）。異菌脲對人參灰霉病菌EC50為0.16～5.43 μg·mL-1，均值為（2.37±0.11）μg·mL-1。其中，敏感菌株24 株（23.53%）、低抗菌株16 株（15.69%）、中抗菌株62 株（60.78 %）。黑龍江、吉林、遼寧敏感菌株分別占33.33%、20%、14.29%，EC50均值分別為（2.12±0.18）、（2.42±0.17）、（2.71±0.25）μg·mL-1。黑龍江遜克人參灰霉病菌對異菌脲的抗藥性最強，與其他人參產區(qū)灰霉病菌對異菌脲抗性的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 人參灰霉病菌對異菌脲的抗性情況

3.3 人參灰霉病菌對嘧霉胺的抗性水平

根據(jù)嘧霉胺抗性將供試人參灰霉病菌分為敏感、中抗、高抗3 個等級（表5）。嘧霉胺對人參灰霉病菌的EC50為0.04～78.30 μg·mL-1，均值為（18.42±1.94）μg·mL-1。其中，高抗菌株71株（69.61%）、敏感菌株28 株（27.45%），中抗菌株3 株（2.94%）。嘧霉胺對黑龍江、吉林、遼寧人參灰霉病菌的EC50均值分別為（11.34±2.49）、（23.96±3.28）、（18.69±3.96）μg·mL-1，敏感菌株分別占58.33%、6.67%、19.05%。黑龍江伊春人參灰霉病菌對嘧霉胺最敏感；吉林靖宇人參灰霉病菌對嘧霉胺抗性最強。

表5 人參灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

4 討論

灰霉病菌具有繁殖快、遺傳變異大、適合度高等特點，極易對殺菌劑產生抗藥性[19]。自20 世紀70 年代，苯并咪唑類、二甲亞酰胺類、苯氨基嘧啶類等殺菌劑先后引入我國，用于灰霉病防治。但是，不同農作物上的灰霉菌很快對上述殺菌劑產生了抗藥性，導致病害田間防效下降甚至完全喪失[18]。

多菌靈、苯菌靈等苯并咪唑類化合物是最早用于灰霉病防治的一類內吸性化學殺菌劑。目前，國內外多種農作物上的灰霉病菌已對該類殺菌劑產生了較強的抗藥性[7]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，課題組2018 年從我國人參主產區(qū)分離的102 株人參灰霉病菌均對多菌靈表現(xiàn)極強的抗藥性，說明多菌靈在人參灰霉病防治上已經失去應用價值，建議在人參生產上停止使用多菌靈防治灰霉病。

二甲酰亞胺類殺菌劑是20 世紀70 年代繼苯并咪唑類殺菌劑之后開發(fā)的一類廣譜殺菌劑，包括異菌脲、腐霉利等。目前生產上也已出現(xiàn)異菌脲、腐霉利抗性灰霉菌株[20]。研究發(fā)現(xiàn)，農作物灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率呈逐年升高的趨勢[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，我國人參主產區(qū)灰霉病菌未產生異菌脲高抗菌株，而中低水平抗性菌株的EC50也較低，說明異菌脲田間抗性風險較低。因此，在人參灰霉病防治上，應結合當?shù)鼗颐咕昕顾幮运街贫茖W合理的防控方案。在異菌脲抗性水平相對較高的地區(qū)（如遜克、長白、集安、本溪等地），建議限制異菌脲的使用；而在其他異菌脲相對敏感的人參產區(qū)，該殺菌劑可以繼續(xù)使用，但應加強灰霉病菌對異菌脲的抗藥性監(jiān)測。

苯氨基嘧啶類化合物是20 世紀90 年代研發(fā)的專門用于灰霉病防治的化學殺菌劑，嘧霉胺、嘧菌胺和嘧菌環(huán)胺等屬于該類產品。近年研究發(fā)現(xiàn)，我國灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性愈來愈強[18,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，供試102 株人參灰霉病菌中嘧霉胺抗性菌株約占70%，且絕大部分為高抗菌株，這與國內同類報道結果基本一致[10]。此外，不同省份人參灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性存在很大差異。吉林人參產區(qū)嘧霉胺高抗菌株已成為人參灰霉病菌中的優(yōu)勢種群，建議吉林省停止將嘧霉胺用于人參灰霉病防治；而黑龍江伊春、遼寧丹東等人參主產區(qū)仍以嘧霉胺敏感菌株為主，建議將嘧霉胺與其他灰霉病殺菌劑混合使用，同時密切關注嘧霉胺抗性菌株動態(tài)變化，以延緩嘧霉胺高抗藥性菌株的產生。