傅丹 張素華 沈德娟 居云 吳麗娟

圓錐動(dòng)脈干畸形（conotruncal defects,CTD）是指胚胎期間圓椎動(dòng)脈干發(fā)育異常的復(fù)雜性先天性心臟畸形，由圓錐動(dòng)脈干段發(fā)育受到干擾或發(fā)育停滯所致，包括法洛四聯(lián)癥、肺動(dòng)脈閉鎖、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、右心室雙出口、永存動(dòng)脈干等，約占先天性心臟病的20%～30%，占青紫型先天性心臟病的70%，病情較為嚴(yán)重，胎兒出生后預(yù)后較差[1-2]。因此，對(duì)CTD胎兒進(jìn)行正確的產(chǎn)前診斷和預(yù)后評(píng)估極為重要。先天性心臟病的病因尚不完全明確，大致可分為遺傳因素、環(huán)境因素及藥物因素等，目前認(rèn)為遺傳因素在其中的作用更大[3]。研究發(fā)現(xiàn)，染色體異常可以導(dǎo)致發(fā)育遲緩、智力障礙、自閉癥、精神疾病及多系統(tǒng)先天性畸形，可能與CTD的發(fā)生相關(guān)聯(lián)[4-5]。本研究探討136例CTD胎兒的產(chǎn)前診斷結(jié)果和臨床結(jié)局，并分析CTD與染色體異常的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2012年1月至2021年12月在蘇北人民醫(yī)院經(jīng)產(chǎn)前胎兒畸形篩查確診胎兒CTD并進(jìn)行胎兒染色體檢查的136例孕婦（均為單胎妊娠）為研究對(duì)象，孕婦年齡20～40（28.31±4.53）歲，均于孕中期經(jīng)胎兒超聲心動(dòng)圖檢查確診CTD。根據(jù)CTD超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)及亞型分類標(biāo)準(zhǔn)，136例CTD胎兒中法洛四聯(lián)癥58例、肺動(dòng)脈閉鎖11例、完全性大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位39例、右心室雙出口25例、永存動(dòng)脈干2例、主動(dòng)脈弓離斷1例；根據(jù)CTD是否合并心內(nèi)或心外畸形，136例CTD胎兒可分為單純組（72例）、合并其他心內(nèi)畸形組（43例）、合并心外畸形組（4例）、同時(shí)合并心內(nèi)、心外畸形組（14例）、僅合并超聲軟指標(biāo)異常組（3例）等5組，后4組統(tǒng)稱非單純型CTD。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國出生缺陷防治報(bào)告》[6]中CTD胎兒診斷標(biāo)準(zhǔn)；單胎妊娠者；在蘇北人民醫(yī)院進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查及遺傳學(xué)檢查者（包括羊水穿刺產(chǎn)前診斷或引產(chǎn)后胎兒組織檢測）。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天性心臟畸形診斷不明確；非上述6種類型CTD；雙胎妊娠者；孕婦患有妊娠期糖尿病或心臟病等。

1.3 方法

1.3.1 超聲心動(dòng)圖檢查 采用超聲心動(dòng)圖對(duì)可疑胎兒畸形者進(jìn)行檢查。使用彩色多普勒超聲儀，探頭頻率為3.5～5.0 MHz，孕婦取仰臥位，先對(duì)胎兒進(jìn)行常規(guī)檢查，評(píng)估胎兒發(fā)育情況，篩查有無心外畸形；確定胎方位后，依次獲取胎兒上腹部橫切面、四腔心切面、左心室流出道切面、右心室流出道切面、三血管氣管切面等5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)切面，以及三血管切面、主動(dòng)脈弓長軸切面、動(dòng)脈導(dǎo)管弓長軸切面、腔靜脈長軸切面、心底大動(dòng)脈短軸切面、雙心室短軸切面等6個(gè)切面，運(yùn)用心臟節(jié)段分析法觀察心房與心室、心室與大動(dòng)脈的連接關(guān)系，檢查室間隔、心室壁及心包有無異常；同時(shí)利用彩色多普勒超聲儀監(jiān)測胎兒心臟血流動(dòng)力學(xué)變化情況。

1.3.2 染色體G顯帶核型分析 按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對(duì)羊水或臍血樣本進(jìn)行染色體核型分析。具體步驟：使用超聲診斷儀，選擇穿刺點(diǎn)和穿刺角度，對(duì)妊娠18～24周的孕婦行羊膜腔穿刺，取羊水20.0 ml；1 800 r/min離心10 min后去上清液，取約2 ml細(xì)胞輕輕吹打混勻后正常培養(yǎng)8～10 d；細(xì)胞收獲后先加秋水仙素處理，再使用1%枸櫞酸三鈉液低滲后收集細(xì)胞。對(duì)妊娠24周后的孕婦行臍血管穿刺，取臍血1.5～2.0 ml，分離收集細(xì)胞并正常培養(yǎng)70 h，隨后加秋水仙素繼續(xù)培養(yǎng)2 h；收獲細(xì)胞，離心，棄上清液，加入氯化鉀溶液低滲處理。所有細(xì)胞樣本均用新鮮配置的甲醇-冰醋酸固定液（體積比為3∶1）固定，離心后制成細(xì)胞懸液，滴片，并于56℃烤箱烤片過夜；過夜后用濃度0.02%胰蛋白酶消化，Giemsa染色，流水沖洗晾干，即可進(jìn)行染色體核型分析。

1.3.3 染色體低深度全基因組高通量測序分析 按照DNA提取的標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)羊水細(xì)胞、臍血淋巴細(xì)胞或胎兒組織進(jìn)行基因組DNA提取及純化。使用短串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記對(duì)組織DNA與母血DNA進(jìn)行檢測，對(duì)樣本母源污染情況進(jìn)行判斷。采用酶切方式將50 ng基因組DNA切割成300 bp大小的DNA片段，通過末端修復(fù)，加接頭，PCR富集后磁珠純化，制備DNA文庫。DNA文庫使用Nextseq 500平臺(tái)（美國Illumina公司）進(jìn)行大規(guī)模平行測序，采用FASTQ數(shù)據(jù)質(zhì)控，檢測分析非整倍體及全基因組范圍拷貝數(shù)變異（copy number variant,CNV）。采用ChAS2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)判斷，將樣本DNA序列與已知人類參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，檢索DECIPHER、OMIM、Clinvar、DGV等數(shù)據(jù)庫，獲取基因組范圍以及缺失或重復(fù)的功能和關(guān)聯(lián)表型的注釋，參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)指南，對(duì)CNV≥100 kb的片段進(jìn)行客觀全面的評(píng)價(jià)，分為致病性、可疑致病、意義不明、可能良性及良性。采用熒光定量PCR對(duì)致病性、可疑致病及意義不明的CNV進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)意義不明的CNV胎兒父母外周血樣本進(jìn)行低深度全基因組高通量測序分析，判斷胎兒CNV是遺傳自父母還是新發(fā)。

1.3.4 病例隨訪 通過電話跟蹤隨訪孕婦至預(yù)產(chǎn)期后6個(gè)月，了解孕婦臨床結(jié)局和活產(chǎn)新生兒情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體異常情況分析 136例CTD胎兒中檢出染色體異常27例，檢出率為19.85%，其中染色體數(shù)目異常13例，致病性CNV 14例。13例染色體數(shù)目異常中，13-三體綜合征、18-三體綜合征、21-三體綜合征各4例，45 X 1例。14例致病性CNV中，22q11.2微缺失綜合征10例，17p11.2微缺失綜合征2例，8p21.3微重復(fù)綜合征1例，2p24.3微重復(fù)綜合征1例。對(duì)14例致病性CNV胎兒的父母進(jìn)行檢測以判斷染色體異常來源，發(fā)現(xiàn)新發(fā)變異10例，3例為父源傳遞，1例為母源傳遞。圖1（見插頁）為完全性大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位的典型圖像，該病例的產(chǎn)前診斷結(jié)果提示為22q11.2微缺失綜合征。圖2為22q11.2微缺失綜合征胎兒及其父母的CNV檢測結(jié)果，其中胎兒檢測到22q11.2上的微缺失片段，而父、母結(jié)果均正常。

圖1 完全性大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位的典型圖像（a：四腔心切面，房室連接正常；b：主動(dòng)脈發(fā)自右心室；c：肺動(dòng)脈發(fā)自左心室；d：主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈起始段交叉關(guān)系消失，呈平行排列）

2.2 不同類型CTD胎兒染色體異常情況比較 27例染色體異常中，永存動(dòng)脈干胎兒的染色體異常檢出率最高，完全性大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位胎兒的染色體異常檢出率最低，主動(dòng)脈弓離斷胎兒中未檢出染色體異常，除永存動(dòng)脈干和主動(dòng)脈弓離斷因病例數(shù)較少未納入分析外，其他各類型CTD染色體異常檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 不同類型CTD胎兒染色體異常情況比較

2.3 不同合并心臟畸形分組CTD胎兒染色體異常情況比較 27例染色體異常中，合并心外畸形、同時(shí)合并心內(nèi)、心外畸形胎兒的染色體異常檢出率較高，單純組胎兒的染色體異常檢出率最低，合并心外畸形組和僅合并超聲軟指標(biāo)異常組因病例數(shù)較少未納入分析，其他各分組CTD胎兒染色體異常檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同合并心臟畸形分組CTD胎兒染色體異常情況比較

2.4 隨訪結(jié)果 136例CTD胎兒中成功隨訪到130例，隨訪成功率為95.59%。130例CTD胎兒中有82例引產(chǎn)，引產(chǎn)率為63.08%，所有27例染色體異常均為引產(chǎn)胎兒，占比為32.93%；48例胎兒順利出生，其中有4例臨床結(jié)局與產(chǎn)前診斷不一致，見表3。

表3 臨床結(jié)局與產(chǎn)前診斷不一致CTD胎兒隨訪結(jié)果

3 討論

先天性心臟病是最常見的一類缺陷性疾病。CTD在先天性心臟病中的比例較高，胎兒病情較重，預(yù)后較差，容易在嬰幼兒期死亡[7]。目前，臨床主要運(yùn)用超聲心動(dòng)圖檢查于產(chǎn)前對(duì)CTD進(jìn)行診斷，準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上[8]。近年來研究表明，染色體異常與胎兒發(fā)生CTD的聯(lián)系十分密切，產(chǎn)前診斷的CTD中，染色體異常率高達(dá)20%[9]。

先天性心臟病的病因多種多樣，通常由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致，目前遺傳因素的影響研究日益受到重視，CTD的遺傳學(xué)研究也取得了諸多研究成果[10]。先天性心臟病的相關(guān)基因十分復(fù)雜，這些相關(guān)基因在蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)間和空間調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，當(dāng)圓錐動(dòng)脈干發(fā)育的相關(guān)基因及其產(chǎn)物異常時(shí)，心室流出道和大動(dòng)脈也會(huì)出現(xiàn)發(fā)育異常[11-12]。染色體畸變可能導(dǎo)致相應(yīng)基因出現(xiàn)變化，影響相應(yīng)蛋白質(zhì)合成，從而影響胎兒心臟形成和發(fā)育，最終導(dǎo)致CTD的發(fā)生[13]。無論染色體數(shù)目異常還是結(jié)構(gòu)異常均可導(dǎo)致胎兒發(fā)生CTD，因而對(duì)CTD胎兒進(jìn)行染色體檢查尤為重要。本研究運(yùn)用染色體G顯帶核型分析和染色體低深度全基因組高通量測序，結(jié)果顯示，136例CTD胎兒中檢出27例染色體異常，檢出率為19.85%，其中染色體數(shù)目異常13例，致病性CNV 14例，說明CTD與染色體異常之間具有一定聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，永存動(dòng)脈干胎兒的染色體異常檢出率較高，這可能是因?yàn)楸狙芯考{入該類型病例數(shù)較少，檢測結(jié)果不具有代表性；肺動(dòng)脈閉鎖、右心室雙出口、法洛四聯(lián)癥染色體異常檢出率也較高，而完全性大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位染色體異常檢出率最低，與郝曉艷等[14]發(fā)現(xiàn)法洛四聯(lián)癥、肺動(dòng)脈閉鎖染色體異常檢出率較高的結(jié)果相似，提示不同類型CTD可能有共同的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，但不同類型CTD合并染色體異常的概率不同。

本研究結(jié)果還顯示，合并心外畸形、同時(shí)合并心內(nèi)、心外畸形胎兒的染色體異常檢出率較高，而單純組胎兒的染色體異常檢出率最低。Lin等[15]發(fā)現(xiàn)合并心外畸形胎兒的染色體異常率為58.33%，同時(shí)合并心內(nèi)、心外畸形胎兒的染色體異常率為35.00%，與本研究結(jié)果相似，可見由于不同染色體承載的基因不同，導(dǎo)致心臟畸形的復(fù)雜程度及合并心外畸形的概率也不同。

本研究中隨訪結(jié)果顯示，136例CTD胎兒中有48例胎兒順利出生，其中4例產(chǎn)前診斷與臨床結(jié)局不一致，主要表現(xiàn)為CTD類型不一致，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能與圓錐動(dòng)脈干畸形的起源和超聲診斷技術(shù)有關(guān)。

圓錐動(dòng)脈干的胚胎發(fā)育過程十分復(fù)雜，任何時(shí)間和部位都可能發(fā)生不同程度的異常。CTD各類型之間互相關(guān)聯(lián)、互相過渡，其在解剖學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)上既有相似性，又有各自獨(dú)一無二的特征，因而部分患者難以得到明確的診斷結(jié)果[16]。盡管CTD患者真實(shí)的胚胎發(fā)育過程不完全清楚，但可以肯定的是圓錐間隔發(fā)育完整、分隔均勻、螺旋式生長及瓣下圓錐結(jié)構(gòu)與心室對(duì)接良好等發(fā)育部分是整體且同時(shí)進(jìn)行的，其與心血管系統(tǒng)內(nèi)的血流動(dòng)力學(xué)也存在緊密的聯(lián)系[17]。圓錐間隔發(fā)育不良可導(dǎo)致肺間隔缺損，并發(fā)半月瓣發(fā)育異常，并可能導(dǎo)致共同動(dòng)脈干；而圓錐間隔發(fā)育完整但分隔不均則可導(dǎo)致法洛四聯(lián)癥；螺旋式生長異常會(huì)導(dǎo)致大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、右心室雙出口等；若瓣下圓錐結(jié)構(gòu)與心室對(duì)接不良則導(dǎo)致法洛四聯(lián)癥、共同動(dòng)脈干等[18]。

超聲心動(dòng)圖檢查可準(zhǔn)確評(píng)估胎兒的心臟結(jié)構(gòu)和功能。病理解剖學(xué)將心臟分為心房、心室、大動(dòng)脈3個(gè)節(jié)段以及心房-心室、心室-大動(dòng)脈2個(gè)連接，使用超聲心動(dòng)圖分別觀察心房、房室瓣、心室、動(dòng)脈圓錐及大動(dòng)脈，可有效明確CTD類型[19-20]。但由于肺動(dòng)脈內(nèi)徑過于狹小，超聲心動(dòng)圖檢查可能無法明確顯示其與右心室及主動(dòng)脈之間的關(guān)系，也會(huì)導(dǎo)致誤診。

綜上所述，CTD胎兒的染色體異常率較高，同時(shí)發(fā)生心內(nèi)、心外畸形的CTD胎兒更易伴有染色體異常。產(chǎn)前檢查若發(fā)現(xiàn)胎兒患有CTD或超聲心動(dòng)圖檢查提示CTD胎兒合并多器官異常時(shí)，應(yīng)行介入性產(chǎn)前診斷排除染色體異常。由于本研究納入樣本量較少，無法全面反映部分CTD類型的染色體異常情況，因此后期需擴(kuò)大樣本量以獲取更具說服力的研究結(jié)果，從而更好地指導(dǎo)臨床工作。