HPLC法測(cè)定南方紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ和金松雙黃酮含量*

凌子懿，吳澤君，包 敏，唐小鵬，肖人鐘，丁 野

(1 株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲 412000；2 湖南天大生物科技股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410136；3 湖南省藥品檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410136)

紅豆杉始見(jiàn)于《本草綱目》，記載其可以治療霍亂、傷寒，在我國(guó)藥用歷史悠久。南方紅豆杉來(lái)源為紅豆杉科植物南方紅豆杉Taxuschinensis(Pilger.)Rehd. var.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu的帶葉枝條，其藥材或飲片為廣東、湖北、浙江、上海、安徽等省市中藥材標(biāo)準(zhǔn)或中藥飲片炮制規(guī)范所收載，藥用部位均為帶葉干燥枝條，功效為消腫散結(jié)、通經(jīng)利尿，用于治療腫瘤、糖尿病、腎病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、水腫、風(fēng)濕痹病等癥?，F(xiàn)代研究表明，紫杉醇、10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ等紫杉烷類成分具有抗癌活性[1-2]，金松雙黃酮、銀杏雙黃酮等黃酮類成分具有抗腫瘤、降脂、抗血栓、抗氧化、抗炎、抗骨質(zhì)疏松病等多種藥理作用[3-6]，為南方紅豆杉主要活性成分?！逗笔≈兴幉馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2018年版、《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》2018年版等現(xiàn)行南方紅豆杉藥材和飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅收載了10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ含量測(cè)定項(xiàng)目，無(wú)黃酮類成分質(zhì)量控制指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定南方紅豆杉藥材中紫杉烷類主成分10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、黃酮類主成分金松雙黃酮的含量，并對(duì)湖南、江西、福建等不同產(chǎn)地、不同品種的南方紅豆杉含量進(jìn)行考察，為南方紅豆杉藥材及飲片的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器：美國(guó)Waters-E2695型高效液相色譜儀、Empower色譜工作站，美國(guó)沃特世公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；XSE205DU電子分析天平，梅特勒托利多有限公司。

藥材：南方紅豆杉藥材共16批，其中普通品種樣品10批，藥用型優(yōu)樹(shù)品種樣品6批。經(jīng)株洲市食品藥品檢驗(yàn)所吳澤君主任藥師鑒定為紅豆杉科植物南方紅豆杉Taxuschinensis(Pilger.)Rehd. var.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu的帶葉枝條。

試劑：10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(批號(hào)：PRF20031626，含量：98%)成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；金松雙黃酮(批號(hào)： PRF9110541；含量：98%)成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，以甲醇為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，0.1%冰醋酸為流動(dòng)相C，進(jìn)行梯度洗脫，見(jiàn)表1；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：232 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成單一對(duì)照品貯存液，精密量取單一對(duì)照品貯存液適量，加無(wú)水乙醇制成10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ濃度為216.0 μg·mL-1、金松雙黃酮濃度為200.9 μg·mL-1混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.3 供試品溶液及空白溶液的制備

取藥材粉末(過(guò)四號(hào)篩)0.2 g，精密稱定，置錐形瓶，加入無(wú)水乙醇25 mL，超聲45 min，放冷，再稱定重量，加無(wú)水乙醇補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。不加供試品，同法操作，即得空白溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸收對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用無(wú)水乙醇稀釋制成10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ濃度為0.8640、2.160、4.320、10.80、21.60、43.20、216.0 μg·mL-1，金松雙黃酮濃度為0.8036、2.009、4.018、10.04、20.09、40.18、200.9 μg·mL-1系列溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，對(duì)照品溶液峰面積(Y)縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮回歸方程分別為Y=7871.5X-3649.7， r=0.9999，Y=1523.6X+7755.3， r=0.9997，線性范圍分別為0.8640～216.0 μg·mL-1，0.8036～200.9 μg·mL-1。結(jié)果表明2種成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 檢出限及定量限

取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以信噪比(S/N)為3所對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限，信噪比(S/N)為10所對(duì)應(yīng)的濃度為定量限。10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ檢出限為0.14 μg·mL-1，定量限為0.43 μg·mL-1，金松雙黃酮的檢出限為0.20 μg·mL-1，定量限為0.67 μg·mL-1。

2.4.3 精密度考察

取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果是10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮峰面積的RSD分別為0.36%，0.61%，表明儀器精密度良好(n=6)。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，12，24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果是10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮的面積的RSD分別為0.75%，0.58%。表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定(n=6)。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一南方紅豆杉樣品6份，按照2.3項(xiàng)下操作，制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果是10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為0.79%、0.72%，表明方法重復(fù)性良好(n=6)。

2.4.6 加樣回收率

取已知含量南方紅豆杉樣品0.1 g，精密稱定，共6份，分別加入一定量10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下制備成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。表明方法準(zhǔn)確性良好。

表2 回收率試驗(yàn)(n=6)Table 2 Recovery rate test(n=6)

2.5 樣品測(cè)定

取16批樣品，按照2.3項(xiàng)下操作，制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。

1.10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ；2.金松雙黃酮圖1 溶劑空白(A)、混合對(duì)照品(B)和 南方紅豆杉藥材樣品(C)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of solvent blank(A)， mixed reference substances(B)and sample of Taxuschinensis var. mairei ramulus et folium(C)

表3 南方紅豆杉含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of contents in Taxus chinensis var. mairei

3 討 論

3.1 提取方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、無(wú)水乙醇、甲醇∶丙酮(3∶1)3種提取溶劑，超聲提取(30、45、60 min)、回流提取(1.0、1.5、2.0 h)2種提取方法。結(jié)合樣品中2種待測(cè)成分的提取率及提取效率，確定樣品提取方法為超聲提取，提取溶液為無(wú)水乙醇，提取時(shí)間為45 min。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相選擇

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)2種待測(cè)成分在200～ 400 nm波長(zhǎng)范圍掃描，考察待測(cè)成分的紫外吸收光譜。結(jié)果10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ在227 nm、232 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收峰，金松雙黃酮在232 nm、330 nm波長(zhǎng)處較強(qiáng)吸收峰。綜合考慮溶劑的截止使用波長(zhǎng)、樣品中雜質(zhì)的干擾以及2種成分的吸收強(qiáng)度，確定232 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ為紫杉烷類生物堿，金松雙黃酮為黃酮類雙黃酮成分，2種成分極性差異很大。本實(shí)驗(yàn)以甲醇、乙腈、水、0.1%冰醋酸4種溶劑作為流動(dòng)相組分，進(jìn)行不同組合的等度或梯度洗脫考察。結(jié)果以本實(shí)驗(yàn)采用的甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸作為流動(dòng)相，梯度洗脫， 2種成分與鄰峰分離度好，分析周期最短。

3.3 不同產(chǎn)地及南方紅豆杉樣品中成分含量的差異

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地、品種南方紅豆杉中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、金松雙黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定研究，結(jié)果顯示普通品種中10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ含量明顯低于藥用型優(yōu)樹(shù)品種，金松雙黃酮含量差異不大；不同產(chǎn)地相同品種的南方紅豆杉樣品中2種成分含量無(wú)明顯差異。故宜選用藥用型優(yōu)樹(shù)品種作用南方紅豆杉藥材和飲片的植物來(lái)源。

4 結(jié) 論

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)單，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于南方紅豆杉藥材及中藥飲片的質(zhì)量控制。