李浩龍, 周 蓉, 蔣芳玲, 文軍琴, 劉 帥, 吳 震
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京210095)
普通栽培番茄大多屬于中度鹽敏感作物,為番茄耐鹽品種選育所提供的材料十分有限。但野生番茄資源含有許多潛在的耐鹽基因,可以為番茄耐鹽品種的選育提供優(yōu)異變異來(lái)源[1-2]。目前,研究者在潘那利番茄(Solanumpennellii)等野生番茄資源中均已鑒定出豐富的耐鹽片段[3-7]。近幾十年來(lái),野生番茄資源中的耐鹽基因被育種學(xué)家廣泛應(yīng)用于栽培番茄的遺傳改良研究中[8-11]。野生番茄中醋栗番茄與栽培番茄的親緣關(guān)系最近,醋栗番茄內(nèi)的耐鹽基因通過(guò)雜交的手段更易轉(zhuǎn)移到栽培番茄中。漸滲系(Introgression line,IL)群體是通過(guò)兩親本不斷回交和自交構(gòu)建而成的,群體內(nèi)各株系基因組與受體親本大致相同,僅有一小部分被供體親本基因組所代替。通過(guò)構(gòu)建醋栗番茄IL群體并篩選耐鹽株系,對(duì)挖掘醋栗番茄中優(yōu)異耐鹽基因具有重要意義。
隨著番茄的生長(zhǎng)發(fā)育,對(duì)鹽脅迫的敏感程度逐漸降低,苗期是對(duì)鹽脅迫最敏感的時(shí)期之一[12]。番茄的耐鹽性屬于多基因控制的性狀,單指標(biāo)難以準(zhǔn)確地反映番茄的耐鹽性。近年來(lái),基于多指標(biāo)對(duì)植物耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的方法已在各種作物中廣泛應(yīng)用[13-16]。前人在研究中發(fā)現(xiàn),醋栗番茄(Solanumpimpinellifoliumn)LA2093對(duì)鹽脅迫不敏感,屬于耐鹽番茄種植資源[17]。因此,本研究以耐鹽醋栗番茄LA2093漸滲系(IL)BC3F3代群體(共19個(gè)漸滲系株系)及親本為試驗(yàn)材料,在幼苗期對(duì)各番茄材料的耐鹽相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算耐鹽性系數(shù),然后利用多元分析方法綜合評(píng)價(jià)番茄各株系耐鹽性,篩選出耐鹽株系,并獲得有效評(píng)價(jià)番茄苗期耐鹽性的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果可為耐鹽番茄品種的鑒定和選育提供理論參考,也可為后續(xù)醋栗番茄中耐鹽關(guān)鍵基因的挖掘奠定基礎(chǔ)。
本試驗(yàn)以19個(gè)醋栗番茄單片段漸滲系株系及漸滲系群體親本為試驗(yàn)材料(表1)。19個(gè)單片段漸滲系株系從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)3代回交和2代自交構(gòu)建的BC3F3代漸滲系群體中選出,以栽培番茄(Solanumlycopersicum) Jina 為母本,醋栗番茄(Solanumpimpinellifolium)LA2093 為父本,其滲入片段覆蓋野生番茄全基因組的65%左右。
試驗(yàn)于2020年10月至11月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室中進(jìn)行,播種所用基質(zhì)各成分含量比例為2∶1∶1(草炭∶蛭石∶珍珠巖)。待番茄幼苗長(zhǎng)至2葉1心期時(shí),將長(zhǎng)勢(shì)相同的番茄幼苗移栽到32孔穴盤(pán)中,采用1/2日本園式營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至5葉1心時(shí),以添加含有200 mmol/L NaCl的1/2日本園式營(yíng)養(yǎng)液為處理組,以添加不含NaCl的1/2日本園式營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照組。試驗(yàn)期間營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換1次,每次添加5 L,添加前倒出穴盤(pán)中所有溶液,以保持滲透勢(shì)穩(wěn)定。每個(gè)處理15株,每3株為1個(gè)重復(fù),共5個(gè)重復(fù),數(shù)據(jù)取5個(gè)重復(fù)的平均值。
表1 供試植株材料編號(hào)及滲入片段所在染色體編號(hào)
1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 在鹽處理第10 d,測(cè)量番茄幼苗的株高和莖粗。取出幼苗并用去離子水沖洗干凈,吸干表面水分,稱(chēng)其鮮質(zhì)量;然后將幼苗裝入信封中,在烘箱中先殺青10 min(105 ℃),然后烘48 h(80 ℃)至恒質(zhì)量取出,稱(chēng)其干質(zhì)量。
1.3.2 葉綠素相對(duì)含量 在鹽處理第6 d,取自頂部向下數(shù)第3張完全展開(kāi)的葉片,利用葉綠素儀(SPAD-502 Plus,日本)檢測(cè)葉綠素相對(duì)含量。
1.3.3 丙二醛和過(guò)氧化氫含量 在鹽處理第6 d,取自頂部向下數(shù)第3張完全展開(kāi)的葉片,丙二醛(MDA)含量和過(guò)氧化氫(H2O2)含量的測(cè)定方法參照李合生[18]的方法。
用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元分析(相關(guān)分析、主成分分析、聚類(lèi)分析和逐步回歸分析)。試驗(yàn)所用的計(jì)算公式如下:
單項(xiàng)指標(biāo)耐鹽性系數(shù)(α):
(1)
7個(gè)指標(biāo)中基于MDA和H2O2含量的耐鹽性系數(shù)越高代表越不耐鹽,其余指標(biāo)的耐鹽性系數(shù)越高代表越耐鹽。因此,在對(duì)各指標(biāo)耐鹽性系數(shù)進(jìn)行多元分析時(shí),將基于MDA和H2O2含量的耐鹽性系數(shù)轉(zhuǎn)化為倒數(shù)參與統(tǒng)計(jì)。
各綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值:
(2)
式中,Xi表示第i個(gè)綜合指標(biāo);Xmin表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的最小值;Xmax表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的最大值。綜合指標(biāo)由單項(xiàng)指標(biāo)通過(guò)主成分分析提取得到。
各綜合指標(biāo)權(quán)重:
(3)
式中,Wi表示第i個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度(權(quán)重);Pi表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。
耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值(D):
(4)
由表2可知,供試材料基于株高的耐鹽性系數(shù)(α1)、基于莖粗的耐鹽性系數(shù)(α2)、基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)(α3)、基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)(α4)和基于葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)(α5)與對(duì)照相比整體均有所下降(α<1),而基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)(α6)和基于過(guò)氧化氫含量的耐鹽性系數(shù)(α7)與之相反,均有所增加(α>1)。1號(hào)(母本)和2號(hào)(父本)相比,2號(hào)番茄除基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)(α6)、基于過(guò)氧化氫含量的耐鹽性系數(shù)(α7)低于母本以外,基于其余各指標(biāo)的耐鹽性系數(shù)均高于母本,且與其他19份漸滲系株系相比耐鹽性系數(shù)較高,說(shuō)明受鹽脅迫影響較小,父本番茄中含有耐鹽優(yōu)異基因。此外還發(fā)現(xiàn),19份漸滲系株系的各個(gè)指標(biāo)對(duì)鹽脅迫響應(yīng)程度并不相同,僅用單個(gè)指標(biāo)難以直接確定各株系的耐鹽性。
表2 21份番茄材料基于各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽性系數(shù)
由相關(guān)性分析結(jié)果(表3)可知,基于植株株高的耐鹽性系數(shù)和基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)、基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)、基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)之間,基于莖粗的耐鹽性系數(shù)和基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)、基于鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)之間,基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)和基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)之間,基于整株干質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)和基于葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)之間存在極顯著相關(guān)(P<0.01);基于株高的耐鹽性系數(shù)和基于葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)之間,基于整株鮮質(zhì)量的耐鹽性系數(shù)和基于葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)、基于丙二醛含量的耐鹽性系數(shù)之間存在顯著相關(guān)(P<0.05),其他指標(biāo)間也存在或多或少的相關(guān)性。由上述相關(guān)性分析結(jié)果可知,利用不同指標(biāo)表征番茄耐鹽性時(shí),各指標(biāo)所代表的信息之間存在重疊,同時(shí)各指標(biāo)所代表的番茄耐鹽性程度也不一樣,可能導(dǎo)致最終的分析結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此,需要對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行降維處理,構(gòu)建綜合評(píng)價(jià)指標(biāo),才能更有效地評(píng)價(jià)番茄苗期耐鹽性。
表3 21份番茄材料基于各單項(xiàng)指標(biāo)耐鹽性系數(shù)的相關(guān)系數(shù)矩陣
表4 21份番茄材料苗期耐鹽指標(biāo)主成分分析及權(quán)重
利用公式(2)計(jì)算各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值,利用公式(3)計(jì)算各綜合指標(biāo)的權(quán)重,利用公式(4)計(jì)算獲得各番茄材料的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值(D)(表5)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),2號(hào)父本D值最大,為0.810,耐鹽性最強(qiáng);1號(hào)母本D值為0.340,耐鹽性較弱。19份漸滲系株系的D值范圍為0.161~0.762,其中IL-6號(hào)番茄D值最大,耐鹽性最強(qiáng);IL-18號(hào)番茄D值最小,耐鹽性最弱。如圖1所示,對(duì)各番茄材料D值進(jìn)行聚類(lèi)分析,將父本、母本及19份漸滲系株系分成2類(lèi),耐鹽類(lèi)(Ⅰ):2、IL-6、IL-9和IL-12;不耐鹽類(lèi)(Ⅱ):1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。
表5 21份番茄材料幼苗植株的綜合指標(biāo)、隸屬函數(shù)值、綜合評(píng)價(jià)值和預(yù)測(cè)值
圖1 不同番茄材料D值聚類(lèi)分析結(jié)果Fig.1 D-value cluster analysis of different tomato materials
本研究中,鹽脅迫下各番茄材料的株高、莖粗、整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量和葉綠素相對(duì)含量的耐鹽性系數(shù)與對(duì)照相比整體表現(xiàn)為降低趨勢(shì),而丙二醛和過(guò)氧化氫含量的耐鹽性系數(shù)與對(duì)照相比均升高,且不同材料間各指標(biāo)對(duì)應(yīng)的耐鹽性系數(shù)變化程度不同。對(duì)株高、莖粗、整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量、葉綠素相對(duì)含量、丙二醛含量和過(guò)氧化氫含量7項(xiàng)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的耐鹽性系數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果表明,各指標(biāo)所代表的信息之間存在交叉重疊。因此,僅憑借單個(gè)指標(biāo)無(wú)法全面反映番茄的耐鹽性,需要提取綜合指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)其耐鹽性。耐鹽性系數(shù)可以更加準(zhǔn)確地反映植物的耐鹽能力,目前,已有大量研究以耐鹽性系數(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合多元分析方法綜合評(píng)價(jià)植株耐鹽性[19-24]。本研究以番茄苗期7個(gè)指標(biāo)的耐鹽性系數(shù)或耐鹽性系數(shù)的倒數(shù)為基礎(chǔ),提取了4個(gè)獨(dú)立的綜合指標(biāo),通過(guò)對(duì)4個(gè)綜合指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析并求出各番茄材料的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值。由于耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值是0~1的純數(shù)[25],故可以更加科學(xué)、直觀(guān)地比較各番茄材料的耐鹽性。通過(guò)對(duì)D值聚類(lèi)分析,較為客觀(guān)地將19份漸滲系株系分成耐鹽類(lèi)和不耐鹽類(lèi),其中不耐鹽類(lèi)漸滲系株系有16份,耐鹽類(lèi)漸滲系株系有3份。
本研究通過(guò)對(duì)醋栗番茄漸滲系株系進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià),初步篩選出3個(gè)耐鹽漸滲系株系,分別為IL-6、IL-9和IL-12,其中IL-6耐鹽性最強(qiáng)。3個(gè)耐鹽株系的染色體一小部分被父本醋栗番茄所替代,而其余染色體與母本栽培番茄Jina相同。其中L-9和IL-12株系均含有醋栗番茄第6號(hào)染色體部分片段,IL-6含有醋栗番茄第11號(hào)染色體部分片段。本研究結(jié)果表明,母本為不耐鹽番茄,而父本為耐鹽番茄,耐鹽株系的耐鹽性與其所攜帶的父本染色體滲入片段有關(guān)。后期可通過(guò)耐鹽株系與輪回母本Jina進(jìn)一步雜交并自交多代,構(gòu)建各自耐鹽系亞系群體。利用已公布的醋栗番茄LA2093基因組數(shù)據(jù)[30],進(jìn)一步開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記對(duì)耐鹽亞系群體進(jìn)行基因分型并結(jié)合耐鹽性鑒定,挖掘耐鹽關(guān)鍵基因。利用耐鹽漸滲系株系挖掘耐鹽基因已有相關(guān)報(bào)道,例如余慶輝等[9]利用耐鹽漸滲系株系IL7-5,通過(guò)加密分子標(biāo)記構(gòu)建該片段遺傳連鎖圖譜并進(jìn)行耐鹽鑒定,實(shí)現(xiàn)了Stq7b耐鹽的主效位點(diǎn)精細(xì)定位,并篩選出2個(gè)耐鹽候選基因;周龍溪[8]同樣以耐鹽漸滲系IL7-5與M82為親本構(gòu)建了IL7-5 Sub-ILs漸滲系亞系群體,通過(guò)對(duì)亞系群體進(jìn)行耐鹽性鑒定,最終發(fā)現(xiàn)苗期耐鹽主效QTLStq7位點(diǎn)和6個(gè)耐鹽候選基因。