多次交配對小菜蛾精包形成與生殖力的影響

鄒明民,劉莉莉,董詩杰,黃夢琪,曹敏慧,尤民生,*,彭 露,*

(1.福建農林大學應用生態(tài)研究所,閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室,福州 350002;2.廣東省農業(yè)科學院作物研究所,廣州 510640;3.廣東省農作物遺傳改良重點實驗室,廣州 510640;4.福建農林大學海峽兩岸特色作物安全生產省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,福州 350002;5.福建農林大學,教育部害蟲生態(tài)防控國際合作聯(lián)合實驗室,福州 350002;6.福建農林大學,福建省昆蟲生態(tài)重點實驗室,福州 350002)

在進化過程中，營兩性生殖的不同昆蟲種類發(fā)展出不同的交配策略以獲得對親代或后代最大的生殖利益。昆蟲采取的交配策略通常包括3種形式(Price PWetal.,2011;張詩語等,2015)：(1)單配制(monogamy)，雌雄兩性一生只交配一次。這種交配策略多見于雌雄兩性均具有親代撫育行為的昆蟲，如葬甲科(Silphidae)甲蟲。(2)多配制(polygamy)：可細分為一雌多雄(polyandry)和一雄多雌(polygyny)兩種形式。其中，一雌多雄制即雌性能與多個配偶交配，而雄性通常只交配一次。這種交配策略在動物界中是最稀少的，多見于具有性食同類(sexual cannibalism)行為的物種中，例如亞利桑那螳螂Stagmomantislimbata(Maxwelletal.,2010)；與之相反的，一雄多雌交配策略是動物界中最常見的形式，這類雌蟲可能具有守衛(wèi)(defending)和求偶行為(Alcocketal.,1976)。(3)混交制(promiscuity)，雌雄兩性均能與多個配偶交配。越來越多的研究表明，雌雄的多次交配行為廣泛存在于昆蟲類群中，主要有鞘翅目、膜翅目、鱗翅目、直翅目、雙翅目、半翅目、長翅目、廣翅目等昆蟲種類(Arnqvistetal.,2000;劉興平等,2008)。

交配策略具有可塑性，即同一個物種因地理種群(V?lim?kietal.,2006;V?lim?ki and Kaitala,2006)、生態(tài)環(huán)境(McFarlaneetal.,2011)、個體生理狀態(tài)(Syriatowicz and Brooks,2004;Frickeetal.,2010)和遺傳基礎(Harano and Miyatake,2005;V?lim?ki and Kaitala,2006;Price TARetal.,2011)等因素的差異，其種群或個體間往往會表現(xiàn)出不一樣的交配策略。例如，研究人員曾分別對來自英國(Smith,1956)、西班牙(Holmanetal.,2008)和加拿大(Lizéetal.,2012)的Drosophilasubobscura交配行為進行了研究，結果均表明D.subobscura雌蟲是嚴格的一夫制昆蟲；但Loukas等(1981)在對希臘種群進行研究時卻發(fā)現(xiàn)有20%的雌蟲可以再次交配，并推測D.subobscura雌蟲為多夫制昆蟲。隨后，F(xiàn)isher等(2013)則觀測比較了英國和希臘種群D.subobscura雌蟲在不同實驗條件下的再交配率，結果發(fā)現(xiàn)平均14.4%的雌蟲具有多次交配行為，而不同地理種群雌蟲再交配率沒有顯著差異，但兩個種群雌蟲的再交配行為對溫度變化的響應卻有很大差別。Kaňuch等(2013)比較了來自北歐16個地點的灌叢蟋蟀Metriopteraroeselii雌蟲的再交配率，結果發(fā)現(xiàn)來自高緯度種群雌蟲的再交配次數普遍多于低緯度地區(qū)的；同時雌蟲的體型也影響其交配次數。考慮到交配策略的可塑性，目前通常根據一個種群雌蟲的交配頻率或多次交配的比例來界定昆蟲的交配策略類型：若一個種群中雌蟲的平均交配次數大于1.5次或雌蟲多次交配的比例大于40%，則認為雌蟲是實行多夫制交配策略(Arnqvistetal.,2000;Torres-Vilaetal.,2004)。對于小菜蛾的交配策略，不同學者仍持有不同觀點，且多次交配實驗中僅觀察了雌蟲與同一頭雄蟲的重復交配情況(Wangetal.,2005;譚永安等,2011;Songetal.,2014)，同時多次交配是否帶來生殖效益仍沒有定論。

昆蟲的多次交配對雌雄兩性而言都是一個生殖利益和代價共存的行為，雄蟲的生殖成功與其交配次數密切相關，但是精液的輸出對雄蟲來說是一個巨大的能量損耗(Duplouyetal.,2018)；交配也可引起雌蟲多種生理和行為改變，如：抑制雌蟲再交配、刺激雌蟲排卵、提高雌蟲產卵量和孵化率以及促進卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生等(Avilaetal.,2011;Guédotetal.,2013;Shahidetal.,2016)。交配過程的實質是精液的輸出與接收，精液中除精子外，還包含蛋白、鹽分、糖類、防御物質、脂質、水和微生物等組分(Poiani,2006)。在多數昆蟲中，精液會以精包的形式暫時儲存在交配囊中，精包的完全消耗和降解是雌蟲可再次交配的信號之一，如灶蟋Gryllodessigillatus(Batemanetal.,2001)、煙芽夜蛾Heliothisvirescens(LaMunyon and Huffman,2001)、斜眼褐蝶Bicyclusanynana(Kehletal.,2013)；但也有一些昆蟲交配后只會形成交配塞，如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Lung and Wolfner,1999)；還有一些昆蟲在交配過程中，雄蟲生殖器會刺穿雌蟲的生殖道或表皮，精液則直接通過傷口進入雌蟲體內，如Drosophilaeugracilis(Kamimura,2010)。然而，在交配過程中，小菜蛾雄蟲精液是通過什么形式進入到雌蟲體內目前尚未定論。

小菜蛾是為害十字花科蔬菜最為嚴重的世界性害蟲，每年造成的損失以及防治費用總計可高達40億～50億美元(Furlongetal.,2013)。小菜蛾強大的生殖潛力以及抗藥性的迅速發(fā)展使其成為田間最難防治的害蟲之一(Sunithaetal.,2020)。對于營兩性繁殖的昆蟲而言，交配是其繁育后代實現(xiàn)種群增長的一個必要生理過程。本研究旨在明確小菜蛾G88敏感品系成蟲的交配行為及交配后的生理響應，如：是否形成精包結構，雄蟲多次交配下其精液含量變化及其對雌蟲生殖力的影響，雌蟲是否具有多次交配行為，交配對雌蟲再交配的抑制時長，以及多次交配是否會給雌蟲帶來生殖效應等。研究結果可為雌蟲交配后的生殖行為和生理變化以及雄蟲在生殖調控中的分子機制作用奠定基礎，對于小菜蛾種群監(jiān)測和綜合防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

本研究使用實驗室長期飼養(yǎng)的小菜蛾G88敏感品系，該品系采用人工飼料飼養(yǎng)。幼蟲于7.3 cm(杯底直徑)×10.4 cm(杯口直徑)×8.5 cm(高)的紙杯中取食人工飼料直至化蛹，飼養(yǎng)條件為：溫度25±1℃，RH 70%±5%，光周期16L∶8D。種群延續(xù)：將50～80個蛹放入紙杯中，羽化后的成蟲可自由交配，杯蓋開口并塞入用10%的蜂蜜水浸濕的棉花，為小菜蛾成蟲提供營養(yǎng)補充。實驗用蟲：將蛹分裝到1.5 mL離心管中(1頭/管)單性飼養(yǎng)直至羽化，羽化后第1天記為1日齡，第2天為2日齡，以此類推。

1.2 雌成蟲生殖系統(tǒng)結構觀察

1.2.1雌性生殖腺形態(tài)觀察：將2日齡未交配的小菜蛾成蟲放入3.0 cm(杯底直徑)×4.0 cm(杯口直徑)×3.0 cm(高)的透明塑料杯中進行單對配對，待其交配完成時立即用CO2麻醉，將雌蟲腹部用解剖剪剪下并置于1×PBS溶液中。在顯微鏡下完成解剖并分離出雌成蟲生殖腺，使用顯微鏡自帶軟件進行拍照。使用同樣的方式解剖、拍照和觀察未交配雌成蟲生殖腺。

1.2.2精包結構冷凍切片觀察：解剖和分離交配后雌成蟲交配囊，隨后立即將樣本包埋入OTC包埋劑(SAKURA)中。于-80℃中放置12 h后，使用冷凍切片機(Shandon Cryotome FSE)進行5 μm厚度半薄切片。將切片移入干凈載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP5)進行拍攝。

1.3 交配行為特性和生殖力觀測

1.3.1交配能力測定：將2日齡未交配的小菜蛾成蟲分別放入塑料杯中進行單對配對，每20 min觀察并記錄一次交配情況，持續(xù)12 h。待交配結束后，立即將雌雄分開并置于新的塑料杯中。而后在杯中放入2日齡未交配的另一性別成蟲，每20 min中觀察并記錄交配情況，持續(xù)12 h。該試驗設3次重復，每個重復處理20對小菜蛾成蟲。

1.3.2雌成蟲精包的消耗：將45對2日齡未交配的小菜蛾成蟲分別放入塑料杯中進行單對配對，每20 min觀察一次交配情況。待交配結束后，立即取出雌成蟲,解剖交配后2 h 和12 h的雌成蟲個體(交配后不同時間各15頭)，分離出交配囊，拍照觀察交配囊內精包的消耗情況。

1.3.3多次交配對雄成蟲射精量的影響：將30對2日齡未交配的小菜蛾成蟲分別放入塑料杯中進行單對配對，觀察并記錄每對試蟲的交配時長。待交配結束后，取出雄成蟲做兩種處理：(1)將15頭雄成蟲置于新的塑料杯中，放入2日齡未交配的雌成蟲進行單對配對，觀察并記錄每對試蟲的交配時長；(2)其余15頭雄成蟲單性飼養(yǎng)于新的塑料杯中，24 h后放入2日齡未交配的雌成蟲進行單對配對，觀察并記錄每對試蟲的交配時長。在交配結束后，立即解剖并分離出所有供試雌成蟲的交配囊，拍照并計算精包大小(面積)。

1.3.4多次交配對雌成蟲生殖力的影響：將單對2日齡未交配的小菜蛾成蟲分別放入塑料杯中進行配對，每20 min觀察一次交配情況。交配結束后，取出雌蟲做兩種處理：(1)放入新的2日齡未交配雄成蟲，每20 min觀察一次交配情況，持續(xù)12 h。期間觀測到再交配行為的雌成蟲個體記為有效的多次交配雌成蟲。記錄15頭有效多配雌成蟲交配后3 d內的產卵量和卵孵化率，觀察期間不移走雄成蟲；(2)另15頭雌蟲單性飼養(yǎng)于新的塑料杯中，記錄每頭雌成蟲交配后3 d內的產卵量和卵孵化率，3 d后解剖并分離出所有供試雌成蟲的交配囊，拍照并計算交配囊內精包的個數。

1.4 數據分析

使用SPSS 19.0軟件進行數據統(tǒng)計分析。多組數據比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey HSD檢驗；兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 雌成蟲生殖系統(tǒng)結構

未交配小菜蛾雌成蟲交配囊大約呈圓形扁平狀，半透明狀，交配囊內未發(fā)現(xiàn)Signa結構(Sánchezetal.,2011)；受精囊呈管狀，細長型，受精囊腺位于頂端，呈橢圓型。交配后，雌蟲交配囊明顯膨脹變大，呈圓球狀。交配囊腔內存在精包結構，呈白色，不透明球狀。受精囊內已有精液存在，說明交配短時間內精液即可從精包內轉移到受精囊中(圖1)。為了進一步驗證小菜蛾精包結構，對交配后雌成蟲交配囊進行冷凍切片和觀察，發(fā)現(xiàn)小菜蛾交配囊膜厚度不均，表面粗糙狀；緊貼交配囊膜內側還存在一層厚度均勻的包膜結構，此結構即為精包的包膜外層(envelope)(圖2)。

圖1 小菜蛾雌成蟲生殖腺結構Fig.1 Structure of reproductive gonads of female adults of Plutella xylostellabc:交配囊Bursa copulatrix;sp:精包Spermatophore;s:受精囊Spermatheca;L-FRT:下生殖道Lower reproductive tract.

圖2 小菜蛾雌成蟲交配囊冷凍切片F(xiàn)ig.2 Frozen section of bursa copulatrix of female adults of Plutella xylostellaA:交配囊的冷凍切片F(xiàn)rozen section of bursa copulatrix;B:包膜外層的放大圖Enlarged view of the envelope.紅色箭頭所示為精包的包膜外層。Red arrow indicates the envelope of spermatophore.

2.2 成蟲交配能力及首次交配后精包的消化情況

小菜蛾2日齡成蟲首次交配的響應時間短、成功率高，在20 min,2 h和12 h觀測時間內，其交配成功率分別為86.7%,97.8%和97.8%(圖3)。首次交配結束后，小菜蛾雄成蟲表現(xiàn)出短暫的再交配延遲，20 min內其交配成功率為54.6%，顯著低于首次交配時的(t=4.11,df=4,P=0.015)。而在首次交配后2 h和12 h內，雄成蟲再交配成功率分別為86.9%和100%，與其首次交配時無顯著差異(2 h:t=1.000,df=4,P=0.091;12h:t=1.000,df=4,P=0.374)。小菜蛾雌成蟲則表現(xiàn)出較弱的連續(xù)交配能力，在首次交配后 20 min,2 h和12 h內雌蟲的交配率分別為26.6%,64.6%和83.4%，均顯著低于雌蟲首次交配時的(20 min:t=5.177,df=4,P=0.007;2 h:t=7.460,df=4,P=0.002;12 h:t=4.325,df=4,P=0.012)(圖3)。結果說明，小菜蛾雌雄成蟲均具有多次交配行為特性，而交配對雌成蟲再交配的抑制作用更加明顯。

圖3 小菜蛾成蟲交配能力Fig.3 Mating capability of Plutella xylostella adultsFirst time:成蟲首次交配First mating of the adults;M:雄蟲第2次交配Second mating of the male;F:雌蟲第2次交配Second mating of the female.圖中數據為平均值±標準誤;星號表示兩組間差異顯著(*P<0.05;**P<0.01),ns表示兩組間差異不顯著(P>0.05)(t檢驗)。Data in the figure are mean±SE.Asterisks indicate significant differences between two groups (*P<0.05;**P<0.01),and ns indicate no significant differences between two groups (P>0.05)(t-test).

昆蟲精包的充分消化和吸收是雌蟲再交配的前提之一(Oberhauser,1989)。為了探究小菜蛾雌成蟲再次交配的生理基礎，對其首次交配后精包的消化情況進行了觀察。交配后2 h，雌成蟲交配囊內的精包已有明顯的消耗，其中有40%(6/15)雌蟲的精包已縮小成白色小團塊，交配囊恢復成半透明狀；其余60%(9/15)雌蟲的精液仍充滿整個交配囊，但交配囊有明顯皺縮。在交配后12 h，所有雌成蟲交配囊內的精包已縮小成白色小團塊，交配囊已恢復成半透明狀(圖4)。結果說明，雌成蟲再交配可能取決于首次交配后精包的消化和吸收速率。

圖4 小菜蛾成蟲交配后2 h(A)和12 h(B)的精包形態(tài)Fig.4 Morphology of spermatophore of Plutella xylostella adults at 2 h (A) and 12 h (B) after mating

2.3 雄成蟲不同交配次數對精包形成和雌成蟲生殖力的影響

雄成蟲不同交配次數并不影響交配時長，3組試蟲的交配時長(M1:72.07±2.56;M2:78.60±3.29;M2-24:72.93±3.22)間沒有顯著差異(F2,42=1.35,P=0.268)(圖5:A)。雄成蟲連續(xù)交配顯著影響交配后所形成的精包大小(F3,56=152.49,P<0.001)(圖5:B,C)。雄成蟲首次交配(M1)所形成的精包顯著大于雄成蟲第2次交配(M2:首次交配后立即進行;M2-24:首次交配后恢復24 h)(P<0.05)。M2-24雄蟲所形成的精包雖然相應增大，但與M2相比精包大小沒有顯著差異(P=0.847)。結果說明，雄成蟲第2次交配時的射精量(精包大小)明顯減少，并且很難得到恢復補充。

圖5 小菜蛾雄成蟲交配次數對精包形成和雌蟲生殖力的影響Fig.5 Effects of mating frequency of male adults on the spermatophore formation and female fecundity of Plutella xylostellaA:交配時長Mating duration;B:精包形態(tài)Morphology of spermatophore;C:精包大小Size of spermatophore;D:交配后3 d內的總產卵量Total number of eggs laid within 3 d after mating;E:卵孵化率Egg hatching rate.Virgin:未交配Unmated;M1:第1次交配First mating;M2:第2次交配(首次交配后立即進行)Second mating (immediately after the first mating);M2-24:第2次交配(首次交配后恢復 24 h)Second mating (recovery for 24 h after the first mating).圖中數據為平均值±標準誤；不同字母表示經Tukey HSD檢驗分析在0.05水平差異顯著。Data in the figure are mean±SE.Different letters mean significant difference at the 0.05 level by Tukey HSD test.

雄成蟲不同交配次數下雌成蟲的產卵量存在顯著差異，雄成蟲首次交配所誘導的雌成蟲產卵量(M1:148.53±6.99)顯著高于雄成蟲第2次交配時的(M2:113.53±6.87;M2-24:125.06±6.33)(F2,42=7.00,P=0.002)(圖5:D)。相比于連續(xù)交配，經過24 h恢復的雄成蟲交配后所誘導的雌成蟲產卵量沒有顯著差異(P=0.454)。雄成蟲不同交配次數下雌蟲的卵孵化率同樣存在顯著差異。雄成蟲首次交配所誘導的雌成蟲卵孵化率(M1:89%)顯著高于雄成蟲第2次交配時的(M2:76%;M2-24:74%)(F2,42=8.43,P=0.001)(圖5:E)。結果說明，小菜蛾雄成蟲交配史對雌成蟲的生殖力有明顯的影響。

2.4 雌成蟲多次交配后的精包形成和生殖力

為了驗證雌成蟲多次交配后的生殖力變化，我們進行了雌成蟲與不同雄成蟲的多次交配試驗。小菜蛾的交配次數可以通過交配后交配囊囊內精包的數量來證實(圖6:A)。交配后3 d時間內，多配組小菜蛾雌成蟲的平均交配次數是4.27次，但多次交配并沒有顯著影響雌成蟲的產卵量(t=0.424,df=28,P=0.675)(圖6:B)和卵孵化率(t=0.021,df=28,P=0.983)(圖6:C)。結果表明，小菜蛾雌成蟲多次交配并沒有獲得產卵量和孵化率的收益，雌成蟲只交配1次，就可達到75%以上的產卵量。

圖6 小菜蛾雌成蟲多次交配對精包形成和雌蟲生殖力的影響Fig.6 Effect of multiple mating of female adults of Plutella xylostella on the spermatophore formation and female fecundityA:交配囊Bursa copulatrix (示精包數量不同Showing the number of spermatophores different);B:交配后3 d內的總產卵量Total number of eggs laid within 3 d after mating;C:卵孵化率Egg hatching rate.M:多次交配Multiple mating;S:單次交配Single mating.白色箭頭所示為精包。圖中數據為平均值±標準誤;ns表示兩組間差異不顯著(P>0.05,t檢驗)。Spermatophore is indicated by white arrow.Data in the figure are mean±SE,and ns indicates no significant differences between two group (P>0.05,t-test).

3 討論

在許多昆蟲交配過程中，雄成蟲精液進入雌成蟲交配囊后會形成一個具有堅硬包膜外層的精包結構。在G88敏感品系小菜蛾中，同樣發(fā)現(xiàn)精包結構的存在，其形態(tài)與Yang和Chow(1978)描述的一致。但Justus和Mitchell(1999)在實驗中卻并未發(fā)現(xiàn)類似結構，他們認為小菜蛾精液不形成精包，而是在雌蟲體外囊管末端開口處硬化形成交配塞。這種外部交配塞多見于鱗翅目蝴蝶類昆蟲中，它通常是一個臨時性的結構，起到延遲雌蟲再交配行為的作用。而在一些物種中，外部交配塞也可以永久性地存在于雌蟲腹部，因此也將其稱為封瓣(sphragis)(Carvalhoetal.,2017,2019)。是否不同種群小菜蛾精液組分的差異導致了不同結構的形成，有待進一步的研究。同時，結合本研究精包消化和吸收的觀察結果，推測這種差異也可能是由于觀測時間不同導致的。

小菜蛾雄成蟲具有多次交配的行為，但其生殖力隨著交配次數的增加顯著降低，其原因是雄蟲提供精液的能力逐次降低，并且其射精量很難得到恢復，該結果與Wang等(2005)結果一致。張詩語等(2016)對7科27種蛾類的實驗數據進行Meta分析結果也表明，從總體而言，雄蛾的交配史對其自身的精包大小以及雌蟲的生殖力均具有明顯的負作用。雄性昆蟲還可根據雌蟲的交配狀態(tài)調整自身射精含量或組分的變化，例如：在煙芽夜蛾中，雄蟲與已交配過的雌蟲交配時會提供更大的精包和相同數量的精子，非精子組分的增加可提高雄蟲的精子競爭力(LaMunyon and Huffman,2001)。但小菜蛾雄成蟲與已交配過的雌成蟲交配時，卻只提供較小的精包。在黑腹果蠅中，雌成蟲再交配時其產卵速率并不會得到再次提高，因此當雄成蟲與已交配過的雌成蟲交配時，雄成蟲策略性地減少精液中ovulin蛋白的含量，但是保持性肽的含量不變以抑制雌成蟲的再交配行為(Sirotetal.,2011)。因此，推測小菜蛾雄成蟲精液蛋白在刺激雌蟲排卵、提高產卵量和卵孵化率以及參與精子競爭等方面具有相對獨立的調控機制，所以當雄成蟲與不同交配狀態(tài)雌成蟲交配時可策略性地調整精液蛋白含量或組分的變化，以最小的代價獲得最大的生殖利益。

交配能力測定結果顯示，小菜蛾雌成蟲在首次交配后12 h內的再交配率為83.7%，根據Torres-Vila等(2004)文章中對雌蟲交配策略的界定標準，小菜蛾雌蟲屬于多夫制交配策略。此結果與Wang等(2005)的結果截然相反，作者在實驗中只觀測到19.3%的雌蟲發(fā)生再次交配，因此認為小菜蛾雌蟲采取一夫制交配策略。影響雌蟲交配次數的因素有很多，如地理種群(V?lim?kietal.,2006)、生態(tài)環(huán)境(McFarlaneetal.,2011)、雌蟲個體生理狀態(tài)(Syriatowicz and Brooks,2004;Frickeetal.,2010)和遺傳基礎(Harano and Miyatake,2005;V?lim?ki and Kaitala,2006;Price TARetal.,2011)等因素。比較小菜蛾G88品系與Wang等(2005)所用品系，發(fā)現(xiàn)除了飼養(yǎng)環(huán)境(溫度、濕度和光照時間)相似外，幼蟲食物、種群來源和實驗室馴化時間均有很大差異，這些差異因素是否會導致小菜蛾雌蟲交配能力的差異還有待進一步驗證。小菜蛾雌成蟲通過多次交配并沒有獲得產卵量和卵孵化率收益。相似的結果也見于其他多夫制昆蟲，如蘋果巢蛾Yponomeutapadella(Parkeretal.,2013)、梨小食心蟲Grapholitamolesta(de Moraisetal.,2012)和蔬菜夜蛾Copitarsiadecolora(Callado-Galindoetal.,2013)。許多研究也表明雌蟲多次交配不僅可獲得產卵量和卵孵化率收益，通過接受不同雄蟲的精子還可增加后代基因的多樣性和減少基因不相容性的負作用(Arnqvist and Nilsson,2000;劉興平等,2008)。小菜蛾雌蟲多次交配策略是否可以獲得基因利益，還有待進一步驗證。