右美托咪定對慢性應激抑郁妊娠大鼠子代發(fā)育及空間學習記憶能力的影響

王向陽， 劉安軍， 趙晶

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第960醫(yī)院麻醉科，濟南250031；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第960醫(yī)院康復醫(yī)學科，濟南250031

妊娠是一個復雜的生理心理應激過程，外界環(huán)境、角色改變、身體功能等因素均可以形成應激源，使孕產婦處于高度的應激狀態(tài)，出現抑郁癥狀[1]。妊娠期抑郁癥可以通過影響產婦的生理和心理變化，增加孕吐、產后出血等妊娠并發(fā)癥發(fā)生風險，進而影響新生兒正常生長發(fā)育[2-3]。目前，妊娠期抑郁癥的發(fā)病機制尚不明確，臨床主要采用抗抑郁、抗精神病等藥物緩解抑郁癥狀，但受到妊娠期用藥的限制，其效果并不理想[4]。右美托咪定是一種選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，應用于剖宮產術中可以發(fā)揮鎮(zhèn)定、減輕陣痛等作用[5]。近年來，研究顯示產后早期應用Dex還可以緩解產婦不良情緒，降低產后抑郁癥發(fā)生率，提高產婦睡眠質量，且對新生兒無明顯影響[6]。但目前關于Dex在妊娠期抑郁癥孕婦中的應用報道較少，且其對新生兒生長發(fā)育的影響尚不明確。本研究旨在探究Dex對慢性應激抑郁妊娠大鼠子代發(fā)育及空間學習記憶能力的影響，以期為Dex 在妊娠期抑郁癥孕婦中的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選取60 只SPF 級SD 大鼠，均為雌性妊娠大鼠，大鼠平均日齡為（90±5）d，平均體質量為（270±20）g，所有大鼠均為初次妊娠，均購自廣東醫(yī)科大學動物中心，動物生產許可證號：SCXK（粵）2018-0008，所有大鼠均在本院動物中心實驗室飼養(yǎng)[使用許可證編號：SCXK（魯）20190018]，本實驗已經過動物倫理委員會審核批準，倫理審批號：20191202。

右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，生產批號：2019101213）購自武漢同濟堂大藥房；Ach 試劑盒（生產批號：20190304）、5-HT 試劑盒（生產批號：20190601）、TCh E 試劑盒（生產批號：20190614）均購自江萊生物有限公司；CREB（生產批號：sc-81486）、p-CREB（生產批號：sc-101662）及BDNF（生產批號：sc-20981）蛋白抗體均購自美國Santa Cruz 公司；HRP 羊抗兔IgG（生產批號：sc-2004）、HRP 羊抗鼠 IgG（生產批號：sc-2065）等二抗購自美國Thermo公司。

Morris 水迷宮裝置（XR-XM101 型）購自上海欣欣科技有限公司；跳臺儀（BW 型）購自上海欣曼科教設備有限公司；蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)購自以色列DNR公司；實驗室切片機（LD-66 型）購自長沙益廣制藥機械公司。

1.2 分組及建立模型

選取60 只雌性妊娠大鼠，采用隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組、低劑量右美托咪定組和高劑量右美托咪定組，每組15 只。除對照組外各組均采用慢性輕度不可預見性應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）制作抑郁模型，采用糖水偏好和曠場實驗判定慢性應激抑郁大鼠造模成功與否[7]，若中央區(qū)停留時間延長且糖水偏好降低則判定造模成功。

1.3 藥物干預

所有大鼠完成模型建立24 h 后，低劑量右美托咪定組腹腔注射20 μg·kg-1的右美托咪定，高劑量右美托咪定組腹腔注射40 μg·kg-1的右美托咪定，對照組、模型組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，1次·d-1，連續(xù)注射14 d。

1.4 各組大鼠孕育率、平均產仔率和平均仔鼠成活率統(tǒng)計

大鼠產仔后分別統(tǒng)計產仔數，計算大鼠孕育率，計算方法見公式（1）；統(tǒng)計子代數和子代成活數計算成活率，計算方法見公式（2）。

1.5 子代大鼠生長情況檢測

子代大鼠出生后第20 天開始每10 天稱量1次體質量，持續(xù)2個月。

1.6 子鼠的學習記憶能力檢測

子鼠完成體質量檢測后，將2 月齡的子鼠使用跳臺法檢測子鼠學習記憶能力[8]，記錄動物第1次從平臺跳下所需的時間，包括跳臺潛伏期和觀察期內跳下平臺的次數，即錯誤次數，若觀察期內動物未跳下平臺記為0，比較不同組間子鼠記憶成績的差異。采用Morris 水迷宮法檢測子鼠的空間學習記憶能力[9]，記錄子鼠在120 s 穿臺次數及在平臺象限內停留的時間。采用物體識別記憶檢測子鼠的陳述性記憶能力[10]，采用SuperMaze 視頻分析系統(tǒng)分析大鼠對A1 物體和B1 物體探索時間，大鼠辨別指數計算方法見公式（3）。

1.7 Ach、5-HT含量和TChE活力檢測

完成子鼠學習記憶能力檢測后，采用脫頸椎法處死子鼠，取出大腦海馬區(qū)組織制成勻漿，使用Ach試劑盒、5-HT試劑盒和TChE試劑盒檢測子鼠腦組織 Ach、5-HT 含量和 TChE 活力，檢測過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.8 Western blot 檢測蛋白表達水平

使 用 Western blot 檢 測 CREB、p-CREB 及BDNF 蛋白，取子鼠海馬區(qū)組織，使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉移至PVDF 膜上，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后加入需要檢測蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，以β-actin為內參蛋白，采用顯色液顯色后進行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析，作圖采用GraphPad Prism5軟件，首先采用Grubbs檢驗進行離散值檢驗，剔除異常數據。計量資料采用平均數±標準差（）表示，采用單個樣本K-S檢驗進行正態(tài)分布檢驗，并進行兩獨立樣本方差齊性檢驗，大鼠子代孕育率、平均產仔率和平均仔鼠成活率、子鼠出生后體質量、學習記憶能力檢測結果及相關蛋白相對表達均符合正態(tài)分布和方差齊；組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法；以P＜0.05 表示數據差異有統(tǒng)計學意義，本研究所有檢驗均為雙側檢驗。

2 結果與分析

2.1 各組大鼠抑郁模型造模情況判定

使用曠場實驗評分檢測大鼠造模情況，如表1所示，相比對照組，模型組大鼠中央區(qū)停留時間延長，18 d時糖水消耗減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；相比模型組，低劑量右美托咪定組和高劑量右美托咪定組大鼠中央區(qū)停留時間縮短，18 d 時糖水消耗增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；相比低劑量右美托咪定組，高劑量右美托咪定組大鼠中央區(qū)停留時間縮短，18 d 時糖水消耗增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。造模各組大鼠中央區(qū)停留時間明顯延長，且糖水實驗所消耗糖水量減少表明大鼠造模成功。

表1 4組大鼠中央區(qū)停留時間和糖水消耗比較（）Table 1 Comparison of residence time and sugar water consumption in central area of rats among four groups()

表1 4組大鼠中央區(qū)停留時間和糖水消耗比較（）Table 1 Comparison of residence time and sugar water consumption in central area of rats among four groups()

注：*表示與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；#表示與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；&表示與低劑量右美托咪定組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

18 d 0.84±0.02 0.50±0.02*0.71±0.04*#0.77±0.03#&26.178＜0.001組別（n=15）對照組模型組低劑量右美托咪定組高劑量右美托咪定組F值P值中央區(qū)停留時間/s 4.87±0.73 11.23±2.14*8.68±1.73*#7.32±1.56#&45.354＜0.001糖水消耗/mL 0 d 0.85±0.02 0.86±0.03 0.86±0.04 0.86±0.04 0.562 0.631

2.2 各組大鼠孕育率、平均產仔率和平均仔鼠成活率比較

檢測各組大鼠孕育率、平均產仔率和平均仔鼠成活率，結果如表2所示，模型組大鼠孕育率和子代數與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但子代平均成活數和成活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低劑量右美托咪定組和高劑量右美托咪定組大鼠孕育率和子代數與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），子代平均成活數和成活率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高劑量右美托咪定組大鼠孕育率和子代數與低劑量右美托咪定組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），子代平均成活數和成活率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果表明，右美托咪定可以提高模型大鼠的子代平均成活數和成活率。

表2 4組大鼠孕育率、平均產仔率和平均仔鼠成活率比較（）Table 2 Comparison of inoculation rate,average farrowing rate and average survival rate among four groups ()

表2 4組大鼠孕育率、平均產仔率和平均仔鼠成活率比較（）Table 2 Comparison of inoculation rate,average farrowing rate and average survival rate among four groups ()

注：*表示與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；#表示與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；&表示與低劑量右美托咪定組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

子代成活率/%92.59±3.21 72.78±2.32*87.50±2.36*#92.64±2.11#&18.421＜0.001組別（n=15）對照組模型組低劑量右美托咪高劑量右美托咪定組F值P值孕育率/%100.00 100.00 100.00 100.00 0.000 1.000子代數/只10.80±1.15 11.53±1.02 10.67±1.08 10.86±1.45 1.579 0.205子代平均成活數/只10.00±1.21 7.66±1.09*9.33±0.97*#10.07±1.34#&13.987＜0.001

2.3 各組子鼠出生后體質量比較

檢測子鼠體質量，由圖1 可知，子鼠出生后第20、30、40、50、60 天時，對照組、模型組、低劑量右美托咪定組和高劑量右美托咪定組子鼠體質量比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果表明右美托咪定對模型大鼠的子鼠體質量無明顯影響。

圖1 4組子鼠出生后體質量比較Fig.1 Comparison of weight of offspring rats after birth among four groups

2.4 各組子鼠的學習記憶能力檢測結果

檢測子鼠學習記憶能力，結果如圖2 所示，相比對照組，模型組子鼠逃避潛伏時間、錯誤次數、120 s 穿臺次數、停留時間顯著升高，辨別指數顯著降低（P＜0.05）；相比模型組，低劑量右美托咪定組和高劑量右美托咪定組子鼠逃避潛伏時間、錯誤次數、120 s穿臺次數、停留時間顯著降低，辨別指數顯著升高（P＜0.05）；相比低劑量右美托咪定組，高劑量右美托咪定組子鼠逃避潛伏時間、錯誤次數、120 s穿臺次數、停留時間顯著降低，辨別指數顯著升高（P＜0.05）。結果表明右美托咪定可以提高模型大鼠的子鼠學習記憶能力。

圖2 4組子鼠的學習記憶能力檢測結果比較Fig.2 Test results comparison of learning and memory abilities of offspring rats among four groups

2.5 4 組子鼠腦組織 Ach、5-HT 和 TChE 含量水平比較

檢測子鼠腦組織 Ach、5-HT 和 TChE 含量水平，結果如圖3 所示，相比對照組，模型組子鼠5-HT、Ach 含量水平顯著降低，TChE 含量水平顯著升高（P＜0.05）；相比模型組，低劑量右美托咪定組和高劑量右美托咪定組子鼠5-HT、Ach 含量水平顯著升高，TChE 含量水平顯著降低（P＜0.05）；相比低劑量右美托咪定組，高劑量右美托咪定組子鼠5-HT、Ach 含量水平顯著升高，TChE 含量水平顯著降低（P＜0.05）。結果表明右美托咪定可以調節(jié)模型大鼠子鼠腦組織Ach、5-HT 和TChE水平。

圖3 4組子鼠腦組織5-HT、Ach和TChE含量水平比較Fig.3 Comparison of 5-HT,Ach and TChE levels in brain tissues among four groups

2.6 4 組大鼠腦組織 CREB、p-CREB 及 BDNF蛋白含量水平比較

蛋白質印記實驗結果如圖4 所示，相比對照組，模型組子鼠腦組織 CREB、p-CREB 及 BDNF 蛋白含量水平顯著降低（P＜0.05）；相比模型組，低劑量右美托咪定組和高劑量右美托咪定組子鼠腦組織CREB、p-CREB 及BDNF 蛋白含量水平顯著升高（P＜0.05）；相比低劑量右美托咪定組，高劑量右美托咪定組子鼠腦組織CREB、p-CREB 及BDNF蛋白含量水平顯著升高（P＜0.05）。結果表明右美托咪定可以調節(jié)模型大鼠子鼠腦組織CREB、p-CREB和BDNF水平。

圖4 4組大鼠腦組織CREB、p-CREB及BDNF蛋白含量水平比較Fig.4 Comparison of levels of CREB,p-CREB and BDNF proteins in brain tissues among four groups

3 討論

妊娠期抑郁癥是由于妊娠期心理生理變化引起的一種常見精神疾病，一般表現為記憶力下降、情緒低落等，且會影響新生兒的生長發(fā)育，目前臨床尚缺乏特效治療藥物[11-12]。本研究結果表明，Dex 干預可以明顯降低慢性應激抑郁妊娠大鼠子代逃避潛伏時間、錯誤次數、120 s 穿臺次數和停留時間，提高辨別指數，提示Dex干預可以提高慢性應激抑郁妊娠大鼠的子代空間學習能力。Su等[13]研究顯示，Dex 具有顯著的神經保護作用，可以抑制異氟醚誘導的神經細胞凋亡，促進子鼠腦源性神經營養(yǎng)因子表達，改善成年胎鼠的空間學習記憶能力，減少異氟醚誘導的妊娠中期胎鼠神經退行性變，與本研究結果類似。說明Dex 可能通過影響慢性應激抑郁妊娠大鼠子鼠的腦組織神經營養(yǎng)因子表達，改善子鼠的空間學習能力，但其具體機制尚不明確，有待進一步深入研究。

本研究檢測了子代大鼠相關神經元遞質的水平，結果表明Dex 干預可以提高慢性應激抑郁妊娠大鼠子鼠的Ach、5-HT 水平，降低TChE 水平。Ach 是一種與學習和記憶關系密切的神經遞質，主要由突觸前膜釋放，與突觸后膜上乙酰膽堿受體結合開放離子通道，引起神經元興奮的傳遞[14-15]。5-HT 也是中樞神經系統(tǒng)中參與學習與記憶的一種重要神經遞質[16-17]。鐘毅等[18]研究表明，Dex 可以抑制交感神經遞質釋放，提高迷走神經遞質Ach水平，改善竇性心動過緩家兔的心功能，提示Dex干預可能通過調節(jié)慢性應激抑郁妊娠大鼠子代海馬組織內的神經遞質水平，改善子鼠的學習記憶功能。

本研究發(fā)現，Dex 干預可以促進慢性應激抑郁妊娠大鼠子鼠腦組織中CREB、p-CREB 及BDNF 蛋白表達。CREB 是調控長時程記憶和長時程增強效應的重要基因之一，同時也是調控海馬空間記憶加工的基因[19]。研究表明，磷酸化的CREB 和CRE 結合，可以激活在其調節(jié)結構域中含有的CRE 序列的基因轉錄，從而使得遞質釋放的長時程和短時程易化，促進相關神經興奮遞質的釋放[20]。同時還有研究表明[21]，CREB 參與成癮和學習記憶的形成，通過提高pCREB/CREB 比例可以促進突觸的刺激，提示Dex 干預可能通過促進子鼠腦組織中CREB 蛋白表達，調節(jié)神經遞質釋放，改善子鼠學習記憶能力。BDNF 是一種神經營養(yǎng)因子，主要在中樞神經系統(tǒng)中表達，具有神經保護功能，在突觸的形成、神經突起形態(tài)的維持等方面發(fā)揮重要的作用[22]。Yin 等[23]研究顯示，BDNF 可以刺激 CREB 和 CRE 結合，促進相關神經興奮遞質的釋放，從而實現保持神經興奮的作用。高毅等[24]研究表明，Dex 可以調節(jié)大鼠CREB蛋白表達，發(fā)揮神經保護作用，減輕神經病理性痛大鼠的疼痛感，提示Dex 干預可能通過調節(jié)慢性應激抑郁妊娠大鼠子代海馬組織內的BDNF 表達，影響CREB 的磷酸化，改善子鼠學習記憶功能。

綜上所述，使用右美托咪定作用于親代大鼠可以改善子代鼠的學習記憶能力，其作用機制可能與調控神經遞質和促進CREB信號傳導有關。