水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測(cè)方法分析

王雪 潘發(fā)林 趙瑩

孔雀石綠也稱為堿性綠，具有一定的殺菌作用，用其可以對(duì)魚類中的魚卵寄生蟲等一系列真菌進(jìn)行處理，以此避免細(xì)菌感染問題的發(fā)生。但是此類物質(zhì)自身具有高毒性，可以在魚的體內(nèi)達(dá)成高殘留，一般情況下殘留會(huì)達(dá)到100d以上，如果含量過大，甚至還會(huì)出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的突變副作用，導(dǎo)致畸形。我國(guó)有關(guān)部門針對(duì)此類問題提出了相應(yīng)的策略，從而減少其對(duì)于人體的傷害。在此過程中，我國(guó)研究出了多種孔雀石綠檢測(cè)方式，但是每種檢測(cè)方法都各有利弊，研究人員需要結(jié)合實(shí)際情況合理作出判斷，從而選擇合適的檢測(cè)方法。

一、孔雀石綠的特性和危害

孔雀石綠可以被當(dāng)作三苯甲烷類染料，其化學(xué)別名為四甲基代二氨基三苯甲烷，此類物質(zhì)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后會(huì)加快新陳代謝，并且整體代謝物可以形成脂溶性的無色孔雀石綠。針對(duì)此類問題，我國(guó)研究人員通過研究后選擇利用藥浴的方式進(jìn)行處理，藥浴一般保持在24h內(nèi)。在藥浴開始6h后，魚的體內(nèi)逐步排出了孔雀石綠的殘留物，并且此時(shí)的孔雀石綠殘留達(dá)到高峰;藥浴處理72h之后，魚體內(nèi)的孔雀石綠被排出90%，全部排出則需要720h。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在將近2000h后，魚的體內(nèi)不會(huì)再出現(xiàn)孔雀石綠。上述測(cè)試針的是有色孔雀石綠，對(duì)于無色孔雀石綠而言，在藥浴72h后，可以達(dá)到相應(yīng)的巔峰值，后續(xù)魚自身的代謝逐漸緩慢;到了720h后，魚的代謝可以保持在50%左右，2000h之后進(jìn)行檢測(cè)，魚體內(nèi)不再含有孔雀石綠。

對(duì)于當(dāng)前我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖工作而言，孔雀石綠一般被用于消殺寄生蟲，還可以通過使用孔雀石綠減緩魚出現(xiàn)爛鰓病的情況。由于孔雀石綠自身價(jià)格低廉并且效果較好，因此被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。但是，孔雀石綠自身具有較強(qiáng)的致癌物質(zhì)，還會(huì)導(dǎo)致突變問題，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面需要進(jìn)行高效管控，確保動(dòng)物體內(nèi)的孔雀石綠含量在規(guī)定范圍內(nèi)。對(duì)此，全球很多國(guó)家都出臺(tái)了相應(yīng)的規(guī)范要求，甚至很多國(guó)家還對(duì)此類藥物進(jìn)行了禁用。近年來由于我國(guó)多個(gè)城市出現(xiàn)孔雀石綠超標(biāo)問題，嚴(yán)重影響了我國(guó)水產(chǎn)品出口業(yè)務(wù)，為了杜絕此類事件的發(fā)生，科研人員進(jìn)行了深入探討，以便確保水產(chǎn)品的孔雀石綠含量在可控制的范圍內(nèi)。

二、準(zhǔn)備材料

1.儀器和試劑。（1）儀器。電子分析天平、電子天平、高速冷凍離心機(jī)、酸度計(jì)、超聲波清洗儀、渦旋混合器、固相萃取裝置、溶劑過濾器、液相色譜儀。（2）試劑。乙腈、二氯甲烷、冰乙酸、硼氫化鉀、酸性氧化鋁。

2.孔雀石綠樣本標(biāo)準(zhǔn)。一般情況下，有色孔雀石綠和無色孔雀石綠的含有量存在一定差異性，比如，有色孔雀石綠在樣品中的純度可以達(dá)到98.5%，無色孔雀石綠則可以達(dá)到92%，無色孔雀石綠也可以稱為隱性孔雀石綠。

3.其他耗材和液相色譜條件。（1）其他耗材。有機(jī)濾膜、無機(jī)濾膜、注射器，注射器的主要作用是提取樣品物質(zhì)。（2）液相色譜條件。為了更好地分析孔雀石綠的具體情況，在檢測(cè)過程中應(yīng)用了液相色譜技術(shù)，此類技術(shù)在執(zhí)行的過程中需要滿足一定的條件，才可確保后續(xù)工作可以順利執(zhí)行。首先是色譜柱和流動(dòng)相，后續(xù)結(jié)合乙酸銨緩沖溶液的流入，設(shè)定具體的流速的和色譜柱的溫度，來判定孔雀石綠的具體含量。

三、檢測(cè)方法

隨著水生動(dòng)物的不斷運(yùn)動(dòng)和新陳代謝，其體內(nèi)的孔雀石綠會(huì)逐步透明化，此時(shí)對(duì)于水生物而言，體內(nèi)的孔雀石綠所形成的毒素最高。為了確保水產(chǎn)品的安全問題，檢驗(yàn)人員陸續(xù)開展了水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的檢測(cè)工作，本文探討的檢測(cè)方法主要是理化檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法。

1.前期處理方法。以魚類為基礎(chǔ)，選擇指定數(shù)量的組織肌肉并稱重，結(jié)合實(shí)際需求選擇適當(dāng)?shù)臉悠?，將其放入離心管中，再取出適當(dāng)?shù)脑噭⑵浞湃肱饸浠浫芤褐?，按照旋渦方向進(jìn)行震蕩工作，震蕩時(shí)長(zhǎng)不得超過3min，后續(xù)再放置15min左右，而且在15min內(nèi)應(yīng)該持續(xù)震蕩工作，震蕩結(jié)束后，每隔1min進(jìn)行1次此項(xiàng)工作。繼續(xù)向離心管內(nèi)添加適當(dāng)?shù)脑噭?，再震?min，1min靜置結(jié)束后，向離心管內(nèi)添加酸性氧化鋁，繼續(xù)旋渦震蕩。徹底結(jié)束旋渦震蕩工作后，收集上層溶液，然后向殘留的液體內(nèi)部添加二氯甲烷，劇烈震蕩1min后重復(fù)以上相關(guān)步驟，不斷反復(fù)移除上層溶液，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束為止。

最底層的物質(zhì)需要得到良好的凈化，凈化步驟具體如下：首先將殘留物放置在相應(yīng)的容器內(nèi)，再安裝固相萃取裝置，然后進(jìn)行2次以上的活化工作。轉(zhuǎn)移提取液中的物質(zhì)，利用乙腈溶液先將柱體清洗干凈，清洗結(jié)束后吹干固定柱體。向最底層物質(zhì)內(nèi)加入乙酸銨溶液進(jìn)行洗脫工作，收集相應(yīng)的洗脫溶液，過濾后上機(jī)測(cè)試。進(jìn)行測(cè)試時(shí)要把控好各類溶劑的劑量，結(jié)合實(shí)際需求配比，以便使其在檢測(cè)工作中發(fā)揮出重要作用。

2.理化檢測(cè)法。（1）薄層層析法。薄層層析法主要應(yīng)用硅膠板來分離孔雀石綠，進(jìn)行孔雀石綠檢測(cè)時(shí)的整體效果較差，定量的范圍誤差較大，在檢測(cè)過程中還會(huì)形成較多的化合物，整體濃度較高。因此，此類檢測(cè)方式更適用于高殘留量的基質(zhì)，并不適用于食品檢測(cè)工作。

（2）分光光度法。分光光度法應(yīng)用了分光光度計(jì)，此設(shè)備自身靈敏度較高，可以針對(duì)不同的目標(biāo)化合物作出測(cè)量，還能夠?qū)Φ蜐舛人降幕|(zhì)作出測(cè)量，以此檢測(cè)出相應(yīng)的基質(zhì)。不過，分光光度法也有一定的局限性，需要在水樣中進(jìn)行檢測(cè)，不能應(yīng)用到復(fù)雜基質(zhì)的檢測(cè)工作中。

（3）高壓液相色譜法。高壓液相色譜法在使用時(shí)需要結(jié)合孔雀石綠的沸點(diǎn)和不易揮發(fā)性，主要應(yīng)用色譜分析法來研究液相色譜。根據(jù)相應(yīng)的研究?jī)?nèi)容，操作人員應(yīng)該結(jié)合各類需求，滿足實(shí)現(xiàn)分離的目標(biāo)，后續(xù)通過反向柱達(dá)成相應(yīng)的分離需求，當(dāng)前我國(guó)應(yīng)用較為廣泛的是C18反向柱分離。此類實(shí)驗(yàn)主要通過孔雀石綠的光學(xué)特性，再結(jié)合相應(yīng)的檢測(cè)手段，目前可以利用的檢測(cè)器械首先是可編程的紫外可見檢測(cè)器，其次是紫外線檢測(cè)器，最后是熒光檢測(cè)器。在檢測(cè)結(jié)束后，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示出孔雀石綠在某一結(jié)點(diǎn)上會(huì)出現(xiàn)吸收峰，此時(shí)可以采用紫外線檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于無色孔雀石綠而言，整體吸收峰會(huì)發(fā)生變化，也會(huì)出現(xiàn)熒光液相，所以可以采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

（4）液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)法。此類方式一般會(huì)應(yīng)用紫外線可見儀器和熒光檢測(cè)儀器共同進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果的可靠性一般較高，但是仍然存在假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。所以在水產(chǎn)品檢測(cè)工作中，檢測(cè)人員應(yīng)該確保樣品的定性結(jié)果，在分析有機(jī)小分子時(shí)也要結(jié)合定性的結(jié)果對(duì)其作出確定，還需要在研究過程中滿足相應(yīng)的條件。此類檢測(cè)方式在檢測(cè)孔雀石綠時(shí)，目標(biāo)化合物分離和高壓液相色譜法原理相同，都是采用色譜柱對(duì)其進(jìn)行分離研究，以此提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。除此之外，還可以應(yīng)用質(zhì)譜檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)，以此降低定量所帶來的偏差。

3.免疫學(xué)檢測(cè)法。免疫學(xué)檢測(cè)法又被稱為酶聯(lián)免疫法，基本原理主要是將酶分子與抗體分子相結(jié)合，以此形成相應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物，不斷改變抗體內(nèi)部免疫學(xué)特性，但是此過程并不影響酶的生物學(xué)活性。此類抗體一般會(huì)在固相載體上，這樣才可將其與特性物相結(jié)合。其中，酶的主要作用是利用無色還原轉(zhuǎn)變有色氧化物質(zhì)，讓其出現(xiàn)顏色反應(yīng)，并且針對(duì)不同的狀態(tài)形成不同的顯色反應(yīng)。此類方法也屬于敏感檢測(cè)方法，一般還可分化出多個(gè)類別，孔雀石綠檢測(cè)法采用的是間接競(jìng)爭(zhēng)抑制法，主要應(yīng)用人工抗原酶反應(yīng)，在其內(nèi)部加入適當(dāng)?shù)难寤蛘叽郎y(cè)藥物使其產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)。后期通過洗滌確定抗原結(jié)合體，并且對(duì)其作出標(biāo)記，形成相應(yīng)的底物。此時(shí)酶催化反應(yīng)所形成的反應(yīng)物會(huì)與過程中形成的抗體有一定的等量關(guān)系對(duì)比，據(jù)此對(duì)其內(nèi)部所含有的孔雀石綠作出判斷，并且規(guī)避內(nèi)部的孔雀石綠物質(zhì)，使其達(dá)成轉(zhuǎn)化的目的，最終形成良好狀態(tài)。

四、結(jié)果分析

針對(duì)上述檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)不同的峰值，總結(jié)出了以下內(nèi)容：首先，通過實(shí)驗(yàn)將樣品中的孔雀石綠提取出來，并在規(guī)定時(shí)間內(nèi)對(duì)孔雀石綠的含量作出定性判斷。時(shí)間數(shù)據(jù)跟實(shí)驗(yàn)過程中各類試劑的使用量有一定關(guān)聯(lián)，因此在實(shí)驗(yàn)過程中不僅要滿足實(shí)驗(yàn)需求，還要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)試劑使用量，使檢測(cè)工作更為標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。其次，在實(shí)驗(yàn)過程中要注意實(shí)驗(yàn)方法的選擇，不同的方法適用于不同的實(shí)驗(yàn)工作，也會(huì)讓孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)有不一樣的變化，所以試驗(yàn)工作的質(zhì)量完全取決于實(shí)驗(yàn)人員自身，對(duì)于各類可變量的控制就極為重要。

綜上所述，為了確保水產(chǎn)品的安全問題，檢測(cè)人員應(yīng)該結(jié)合實(shí)際需求，選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方式對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，以此改善水產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題。在檢測(cè)過程中，相關(guān)檢測(cè)人員為了提高檢測(cè)質(zhì)量和水準(zhǔn)，需要不斷進(jìn)行試驗(yàn)，這樣才能提高我國(guó)的水產(chǎn)品檢測(cè)水平。